萊菔硫烷對(duì)阿爾茨海默病的干預(yù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本研究采用APPswe/PS1 dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠，觀察SFN是否可改善其認(rèn)知功能障礙和腦組織病理學(xué)變化，以及突觸標(biāo)志物—突觸后密度蛋白95(PSD95)的表達(dá)情況，并觀察SFN是否可改變?cè)撃Ｐ托∈竽X組織的Ace-H3K9、Ace-H4K12水平、NGF及其受體TRKA、P75NTR表達(dá)水平和自噬水平;此外，以Aβ25-35處理的SH-SY5Y細(xì)胞作為AD模型細(xì)胞，分析SFN對(duì)該模型細(xì)胞Ace-H3K9、Ace

2、-H4K12水平以及HDAC2、TRKA、P75NTR表達(dá)水平變化的時(shí)相分布。以此探討SFN對(duì)AD的干預(yù)作用及其機(jī)制，為AD的預(yù)防及早期干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、APPswe/PS1 dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠鑒定
　　雄性小鼠雜合體種鼠由美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)，健康3月齡雌性C57BL/6小鼠購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌鼠與雄鼠2∶1交配，提取子代小鼠基因組DNA，針對(duì)人APPswe、PS

3、1dE9基因及小鼠內(nèi)參基因合成特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳，觀察電泳條帶，確定小鼠基因型。
　　2、動(dòng)物分組、處理及取材
　　將20只4月齡APPswe/PS1 dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠按窩別和體重隨機(jī)分為AD模型組和AD模型干預(yù)組，同時(shí)設(shè)立野生型小鼠對(duì)照組和野生型小鼠干預(yù)組，并做相應(yīng)處理。
　　3、通過細(xì)胞培養(yǎng)、處理及樣品采集，對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)及小鼠海馬相關(guān)蛋白的檢測(cè)、小鼠腦皮質(zhì)及SH-SY5Y細(xì)胞相關(guān)m

4、RNA轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)、小鼠腦皮質(zhì)及SH-SY5Y細(xì)胞相關(guān)蛋白檢測(cè)分析、小鼠腦組織自噬小泡的檢測(cè)等。并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　結(jié)果
　　1、小鼠一般狀況
　　受試期間各組小鼠未見異常表現(xiàn)及死亡。各組小鼠體重均有所增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、SFN改善AD模型小鼠神經(jīng)行為學(xué)能力
　　(1)曠場(chǎng)試驗(yàn)
　　與野生對(duì)照及野生干預(yù)組相比，AD模型組小鼠穿格次數(shù)和抬頭次數(shù)減少，潛伏期延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與AD

5、模型組比較，AD模型干預(yù)組小鼠穿格次數(shù)和抬頭次數(shù)增加，潛伏期減短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)跳臺(tái)試驗(yàn)
　　與野生對(duì)照及野生干預(yù)組相比，AD模型組小鼠反應(yīng)期延長(zhǎng)，潛伏期縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與AD模型組相比，AD模型干預(yù)組小鼠反應(yīng)期縮短，潛伏期延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(3) Morris水迷宮
　　與野生對(duì)照及野生干預(yù)組相比，AD模型組小鼠逃避潛伏期延長(zhǎng);與AD模型組相

6、比，AD模型干預(yù)組小鼠逃避潛伏期縮短。AD模型組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)少于野生對(duì)照及野生干預(yù)組;與AD模型組小鼠比較，AD模型干預(yù)組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)增多。
　　3、SFN改善AD模型小鼠腦組織病理學(xué)改變
　　(1) ChAT免疫陽性細(xì)胞數(shù)
　　AD模型組小鼠腦皮質(zhì)及海馬CA1、CA3、DG區(qū)ChAT免疫陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于野生對(duì)照及野生干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AD模型干預(yù)組小鼠腦皮質(zhì)及海馬CA1、CA3、DG區(qū)ChAT免疫

7、陽性細(xì)胞數(shù)均多于AD模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2) Psd95 mRNA及其蛋白表達(dá)水平
　　AD模型組海馬CA1、CA3、DG區(qū)PSD95免疫陽性顆粒積分光密度值、腦皮質(zhì)Psd95 mRNA及其蛋白水平明顯低于野生對(duì)照及野生干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AD模型干預(yù)組小鼠海馬CA1、DG區(qū)PSD95免疫陽性顆粒積分光密度值、腦皮質(zhì)Psd95 mRNA及其蛋白水平明顯高于AD模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(

8、3) Aβ斑塊數(shù)
　　與野生對(duì)照及野生干預(yù)組相比，AD模型組小鼠腦皮質(zhì)及海馬Aβ斑塊數(shù)量明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AD模型干預(yù)組小鼠腦皮質(zhì)及海馬CA1、CA2區(qū)Aβ斑塊少于AD模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、SFN上調(diào)AD模型小鼠腦組織TRKA、P75NTR表達(dá)水平
　　AD模型組小鼠腦皮質(zhì)Trka、P75ntr mRNA及其蛋白水平，海馬TRKA、P75NTR免疫陽性顆粒積分光密度值明顯低于野生對(duì)照及野生干

9、預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; AD模型干預(yù)組小鼠上述指標(biāo)明顯高于AD模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NgfmRNA及其蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、SFN改善AD模型小鼠腦組織的自噬水平
　　AD模型組小鼠腦組織自噬小泡紅色熒光積分光密度值、腦皮質(zhì)及海馬LC3蛋白水平明顯低于野生對(duì)照組和野生干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AD模型干預(yù)組小鼠腦組織自噬小泡紅色熒光積分光密度值、腦皮質(zhì)及海馬LC3蛋白水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)意義。
　　6、SFN上調(diào)AD模型小鼠腦皮質(zhì)組蛋白乙?；?br>　　與野生對(duì)照組及野生干預(yù)組相比，AD模型組小鼠腦皮質(zhì)Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與野生對(duì)照組相比，野生干預(yù)組小鼠腦皮質(zhì)Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白相對(duì)表達(dá)量上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與AD模型組相比，AD模型干預(yù)組小鼠腦皮質(zhì)Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白相對(duì)表達(dá)量上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

11、br>　　7、SFN提高Aβ25～35處理SH-SY5Y細(xì)胞活力
　　隨著Aβ劑量的增加，Aβ處理組細(xì)胞活力逐漸下降，其中40、80μM Aβ處理的細(xì)胞活力低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SFN預(yù)處理后各組細(xì)胞活力未見明顯改變。與Aβ處理組相比，SFN可減輕40、80μMAβ處理所致的細(xì)胞活力下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　8、SFN對(duì)Aβ25～35處理的SH-SY5Y細(xì)胞組蛋白乙酰化水平及時(shí)相分布
　　(1) Ace

12、-H3K9蛋白表達(dá)水平及時(shí)相分布
　　與對(duì)照組相比，12h、24 h時(shí)單純SFN組細(xì)胞Ace-H3K9蛋白表達(dá)水平上升;6h、12 h、24 h時(shí)Aβ處理組細(xì)胞Ace-H3K9蛋白表達(dá)水平下降，12h、24 h時(shí)，SFN干預(yù)組細(xì)胞Ace-H3K9蛋白表達(dá)水平均高于Aβ處理組。
　　(2) Ace-H4K12蛋白表達(dá)水平及時(shí)相分布
　　與對(duì)照組相比，24 h時(shí)單純SFN組細(xì)胞Ace-H4K12蛋白表達(dá)水平上升(P＜0.0

13、5);6 h、12h、24 h時(shí)Aβ處理組細(xì)胞Ace-H4K12蛋白表達(dá)水平下降(P＜0.01)。6h、12h、24 h時(shí)，SFN干預(yù)組細(xì)胞Ace-H4K12蛋白表達(dá)水平高于Aβ處理組（P＜0.01）。
　　9、SFN對(duì)Aβ25～35處理的SH-SY5Y細(xì)胞Hdac2mRNA及其蛋白水平的影響及時(shí)相分布
　　(1) Hdac2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及時(shí)相分布
　　與對(duì)照組相比，1h、3h、6h、12h、24 h時(shí)，單純SF

14、N組細(xì)胞Hdac2mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降(P＜0.05或P＜0.01);3h、6h、12 h、24 h時(shí)Aβ處理組細(xì)胞Hdac2mRNA轉(zhuǎn)錄水平上升(P＜0.01);1 h、3h、6h、12h、24 h時(shí)，SFN干預(yù)組細(xì)胞Hdac2mRNA轉(zhuǎn)錄水平低于Aβ處理組(P＜0.05或P＜0.01)。
　　(2) HDAC2蛋白表達(dá)水平及時(shí)相分布
　　與對(duì)照組相比，3h、6h、12h、24 h時(shí)單純SFN組細(xì)胞HDAC2蛋白表達(dá)水平下

15、降(P＜0.05或P＜0.01);6h、12h、24 h時(shí)Aβ處理組細(xì)胞HDAC2蛋白表達(dá)水平上升(P＜0.01);6h、12h、24 h時(shí)SFN干預(yù)組細(xì)胞HDAC2蛋白表達(dá)水平低于Aβ處理組(P＜0.01)。
　　結(jié)論
　　1、SFN可改善APPswe/PS1 dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的認(rèn)知功能損傷、腦皮質(zhì)及海馬膽堿能神經(jīng)元丟失及Aβ沉積，并上調(diào)其降低的Psd95mRNA及其蛋白表達(dá)水平。
　　2、APPswe/P

16、S1 dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦組織Trka、P75ntr mRNA及蛋白水平下降，SFN干預(yù)可減輕上述變化，各組小鼠Ngf mRNA及蛋白水平無明顯差異;SFN干預(yù)可減緩APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦組織自噬水平、腦組織組蛋白乙?；降慕档?。
　　3、SFN對(duì)Aβ25～35所致的SH-SY5Y細(xì)胞活力下降具有明顯的改善作用。Aβ25～35處理的SH-SY5Y細(xì)胞Hdac mRNA及蛋白表達(dá)增多，Ace-H3