炎癥、糖基化終末產(chǎn)物、葡萄糖及胰島素對單核-巨噬細(xì)胞系THP-1細(xì)胞功能的影響.pdf

1、背景與目的:近年來，糖尿病(diabetesmellitus，DM)的炎癥病因?qū)W理論倍受關(guān)注，該理論認(rèn)為DM患者體內(nèi)普遍存在慢性低度炎癥反應(yīng)(Chroniclow-gradeinflammatorydisease)，并且這種低度炎癥反應(yīng)還在進(jìn)一步加重DM，并促進(jìn)一些臨床并發(fā)癥的出現(xiàn)，具體表現(xiàn)在胰島素抵抗的加重、高血壓的惡化、動脈粥樣硬化等心血管疾病的出現(xiàn)以及慢性腎臟病的進(jìn)展等。其中，巨噬細(xì)胞在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的防御作用，而巨噬細(xì)

2、胞活化平衡也是決定炎癥轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵。在2型糖尿病發(fā)展過程中，高糖，高胰島素血癥及糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycationendproduct，AGE)等微環(huán)境引起胰島素源性的炎性因子分泌增加，促使巨噬細(xì)胞活化分泌大量炎性因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等，加劇氧化應(yīng)激，引起組織損傷。近來，旨在研究危重病人血糖控制的NICE-SUGAR研究及預(yù)防糖尿病心血管事件的ACCORD研究均沒有發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)血糖正?；?/p>

3、可減少全因死亡。本實(shí)驗(yàn)從慢性低度炎癥的視角出發(fā)，用人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞作為研究的模型，來研究不同葡萄糖、胰島素和AGE濃度狀態(tài)下及外源性炎性因子脂多糖對中性粒細(xì)胞的吞噬功能和ROS產(chǎn)量的影響，以探索炎癥狀態(tài)下AGE、葡萄糖、胰島素對單核細(xì)胞氧化應(yīng)激及吞噬能力的影響。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 人類急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1（由上海細(xì)胞庫提供）。將THP-1細(xì)胞

4、置入含有的10％胎牛血清的RPMI1640（5.0mmol/L葡萄糖）培養(yǎng)液中，放置于37℃，5％CO2的孵育箱中培養(yǎng)。并在對數(shù)生長期收獲細(xì)胞，使細(xì)胞達(dá)到同步化后加入不同的實(shí)驗(yàn)處理因素。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組
　　 (1)用終濃度為160nmmol/L的PMA誘導(dǎo)生長良好的THP-1細(xì)胞72h，使其分化成巨噬細(xì)胞。
　　 (2)本實(shí)驗(yàn)分別用不同水平的葡萄糖濃度對THP-1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)(5.0、8.0、10.0、15

5、.0、20.0和25mmol/L)，細(xì)胞于37℃，5％CO2的孵育箱中培養(yǎng)72h后，收獲細(xì)胞。
　　 (3)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞再分別用不同濃度的胰島素進(jìn)行對抗(0mIU/L、20mIU/L、50mIU/L、200mIU/L和1000mIU/L)，細(xì)胞于37℃，5％CO2的孵育箱中培養(yǎng)24h后收獲細(xì)胞。
　　 (4)體外人工孵育AGE-BSA，以培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞為模型，首先將細(xì)胞隨機(jī)分成兩組，第一組加入一定蛋白濃度的BSA（

6、終濃度為100ug/ml）作為對照組處理48h;第二組分別加入不同蛋白濃度的AGE-BSA(終濃度為50、100、200、400ug/ml)處理48h后收獲細(xì)胞。
　　 (5)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞置于有外源性炎癥刺激因子LPS（1μg/ml）和無LPS(0μg/ml)的條件中，刺激24h后收獲細(xì)胞，檢測THP-1細(xì)胞的吞噬的功能和氧化應(yīng)激ROS產(chǎn)生的多少情況并進(jìn)行多因素的析因設(shè)計方差分析進(jìn)行組間及組內(nèi)的比較，結(jié)果進(jìn)行比較。
　　

7、 結(jié)果:
　　 1.葡萄糖、AGE、胰島素及LPS對THP-1細(xì)胞ROS釋放的影響
　　 (1)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生ROS的能力從葡萄糖濃度5.0mmol/L至25.0mmol/呈上升的趨勢。
　　 (2)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生ROS的能力從AGE濃度50mg/L至400.0mg/L呈逐步上升的趨勢。
　　 (3)THP-1細(xì)胞在胰島素濃度20.0mu/L與對照組相比，產(chǎn)生ROS的能力是降低的。從胰島素濃度20

8、.0mu/L至1000.0mu/L呈顯著上升的趨勢。
　　 (4)當(dāng)培養(yǎng)液內(nèi)有葡萄糖與1μg/ml脂多糖(LPS)共同培養(yǎng)時，細(xì)胞產(chǎn)生ROS的能力在各葡萄糖濃度均顯著增加，其中在15mmol/L的糖濃度水平ROS的釋放量達(dá)最高值。
　　 (5)當(dāng)培養(yǎng)液內(nèi)有胰島素與1μg/ml脂多糖(LPS)共同培養(yǎng)時，細(xì)胞產(chǎn)生ROS的能力在各胰島素濃度均顯著增加。
　　 (6)當(dāng)培養(yǎng)液內(nèi)有AGE與1μg/ml脂多糖(LPS)共同

9、培養(yǎng)時，細(xì)胞產(chǎn)生ROS的能力雖然和對照組比較是增加的，但是與LPS加入前沒有差異。
　　 2.葡萄糖、AGE、胰島素和LPS對THP-1細(xì)胞吞噬功能的影響
　　 (1)THP-1細(xì)胞吞噬功能從葡萄糖5.0mmol/L到10.0mmol/L無改變，但在葡萄糖15mmol/L時降至最低值，20mmol/L和25mmol/L的吞噬功能也較低。
　　 (2)THP-1細(xì)胞的吞噬能力在各AGE濃度較對照組有明顯的下降。

10、r>　　 (3)THP-1細(xì)胞吞噬功能從胰島素20mu/L和50mu/L無改變，但在200mu/L和1000mu/L的吞噬功能下降。
　　 (4)予1μg/ml脂多糖(LPS)刺激后，THP-1細(xì)胞的吞噬功能在葡萄糖濃度為5mmol/L時最強(qiáng)，細(xì)胞吞噬功能從葡萄糖濃度5.0mmol/L至20.0mmol/L雖較刺激前上升，但和5mmol/L比較升高并不明顯。(5)當(dāng)培養(yǎng)液內(nèi)有胰島素與1μg/ml脂多糖(LPS)共同培養(yǎng)時，細(xì)胞

11、產(chǎn)生吞噬能力能力均顯著增加。
　　 (6)予1μg/ml脂多糖(LPS)刺激后，細(xì)胞吞噬功能AGE濃度50mg/L至400.0mg/L普遍低下。
　　 結(jié)論:1.LPS與AGE均作為炎性因子刺激巨噬細(xì)胞活化，參與炎癥反應(yīng)，加重血糖和胰島素對巨噬細(xì)胞功能影響過程。2.胰島素在生理濃度下，發(fā)揮其抗炎作用;但胰島素抵抗時的濃度，損傷細(xì)胞功能。3.通過本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)觀察，5.0～10.0mmol/L血糖水平范圍可能是機(jī)體對血糖的最佳