澤瀉湯對(duì)血脂調(diào)節(jié)的膽固醇相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化研究.pdf

1、目的：
　　 從中醫(yī)學(xué)的角度出發(fā)，高血脂癥的發(fā)病機(jī)制是本虛標(biāo)實(shí)，本虛的臨床癥狀主要是脾胃氣虛和肝腎陰虛，標(biāo)實(shí)的臨床癥狀表現(xiàn)為血瘀痰濁。高脂血癥的痰濁的產(chǎn)生與脾虛有著非常密切的聯(lián)系，其病機(jī)特點(diǎn)為中虛不運(yùn)水液，水濕之邪上冒清陽(yáng)，從而導(dǎo)致病人苦于頭目眩暈。所以二者同源異流，因而可以用來(lái)治療支飲的澤瀉湯也適用于治療高脂血癥，這實(shí)際上屬于“異病同治”，用該方治療高脂血癥符合中醫(yī)基礎(chǔ)理論?，F(xiàn)代藥理學(xué)和臨床研究表明澤瀉湯具有非常顯著的調(diào)節(jié)血脂

2、異常作用，對(duì)高脂血癥有很好的療效[2-8]。目前對(duì)澤瀉湯降脂方面的研究還比較少見(jiàn)，現(xiàn)有的已經(jīng)闡述的機(jī)理有：影響機(jī)體吸進(jìn)外源性膽固醇，或者是干擾機(jī)體對(duì)內(nèi)源性膽固醇的分解代謝以及干擾機(jī)體的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用[5-8]。這也體現(xiàn)了澤瀉湯對(duì)血脂代謝疾病的多途徑多靶點(diǎn)的整體治療作用效果。但是從分子生物學(xué)角度來(lái)研究澤瀉湯的調(diào)血脂作用機(jī)理，卻仍然處于摸索階段。在實(shí)驗(yàn)中利用高脂飼料來(lái)造高血脂小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過(guò)觀察肝臟組織病理形態(tài)學(xué)上的變化以及測(cè)定血清谷草

3、轉(zhuǎn)氨酶(AST)以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量多少?gòu)亩芯扛哐∈蟾喂δ軗p傷的程度；利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶(RT-PCR)反應(yīng)方法，測(cè)定肝組織中3-羥-3-甲基戊二酰酶A還原酶(HMG-CoA reductase)的表達(dá)情況，固醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白因子-2(SREBF-2)，7α羥化酶(CYP7α1)一些與膽固醇代謝有關(guān)的基因在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)情況以及活性，從而研究高血脂小鼠肝臟脂質(zhì)物質(zhì)代謝紊亂的分子作用機(jī)理。
　　 方法：
　　

4、選取雄性昆明小鼠，實(shí)驗(yàn)前用普通飼料常規(guī)適應(yīng)飼養(yǎng)1w小鼠；之后隨機(jī)分8只為第1組(空白對(duì)照組)繼續(xù)給予普通飼料，對(duì)其余40給予高脂飼料進(jìn)行高脂造模，3w末尾靜脈取血分離血清，用半自動(dòng)生化儀檢測(cè)血脂，若血脂水平升高則說(shuō)明造模成功，隨機(jī)將造模成功的所有小鼠分為5組，每組均為8只。
　　 造模成功后各組以0.01ml·g-1的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，每日1次連續(xù)4w。
　　 (1)空白對(duì)照組：給予普通飼料，灌胃時(shí)包含生理鹽水；

5、>　　 (2)模型對(duì)照組：給予普通飼料，灌胃時(shí)包含生理鹽水；
　　 (3)陽(yáng)性對(duì)照組：給予高脂飼料同時(shí)以6.7mg·kg-1辛伐他汀灌胃；
　　 (4)澤瀉組：給予高脂飼料同時(shí)以2g·ml-1澤瀉單方溶液灌胃；
　　 (5)白術(shù)組：給予高脂飼料同時(shí)以2g·ml-1白術(shù)單方溶液灌胃；
　　 (6)復(fù)方組(澤瀉：白術(shù)=5:2)：喂養(yǎng)高脂飼料同時(shí)以2g·ml-1澤瀉湯復(fù)方溶液灌胃。
　　 各組小鼠均在

6、獨(dú)立的籠子中進(jìn)行飼養(yǎng)，它們可以不受約束地飲水和攝食。實(shí)驗(yàn)期間經(jīng)常觀察小鼠的狀態(tài)情況。需要灌胃的各組每日早上如上述所描述的進(jìn)行。每周對(duì)各小組小鼠稱重一次，根據(jù)每只小鼠的體重來(lái)調(diào)整相應(yīng)的劑量。空腹，頸動(dòng)脈采血，將獲得的血清用于如下一些指標(biāo)的測(cè)定：血清總膽固醇(TC)濃度、甘油三酯(TG)濃度、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量、ALT和AST濃度。肝臟用于組織切片、RNA及脂質(zhì)提取，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)定臟器系數(shù)。
　　 2觀察肝臟組

7、織的形態(tài)和病理變化情況
　　 將摘取的肝組織首先進(jìn)行照相，接著依次經(jīng)過(guò)甲醛的固定，石蠟的包埋，切片，然后HE染色后，通過(guò)光鏡來(lái)觀察肝組織病理學(xué)上變化的情況。
　　 3提取肝臟中的總脂類物質(zhì)成分
　　 首先按照試劑盒說(shuō)明書(shū)上所給出的步驟提取出肝臟總脂，然后測(cè)定肝臟中的膽固醇。
　　 4測(cè)定血清中的膽固醇相關(guān)指標(biāo)、肝臟中的膽固醇
　　 通過(guò)RT-9600型全自動(dòng)生化分析儀來(lái)測(cè)定血脂、血清ALT和血清A

8、ST這些指標(biāo)。
　　 5測(cè)定肝臟組織中血脂相關(guān)的一系列基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量
　　 用兩步法提取總RNA，以β-Actin作為內(nèi)參，用RT-PCR法測(cè)定HMG-CoA reductase，SREBF-2和CYP7α1 mRNAs的相對(duì)表達(dá)量。
　　 結(jié)果：
　　 1.澤瀉、白術(shù)和復(fù)方降低血清中膽固醇相關(guān)指標(biāo)作用情況
　　 與模型組相比，澤瀉組和復(fù)方組中小鼠血清中TG和TC濃度都出現(xiàn)顯著性地降低，

9、同時(shí)血清HDL-C濃度顯著增加，澤瀉、白術(shù)和復(fù)方組小鼠血清ALT、AST活性增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；澤瀉、白術(shù)、復(fù)方均能不同程度降低小鼠肝臟、脾臟系數(shù)；灌胃4w后，與澤瀉組相比，復(fù)方能顯著降低小鼠體重，并且能顯著降低小鼠肝臟系數(shù)。
　　 2.澤瀉、白術(shù)和復(fù)方對(duì)肝組織中膽固醇相關(guān)一系列基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響情況。
　　 當(dāng)高血脂癥時(shí)，一系列與膽固醇代謝有關(guān)的基因表現(xiàn)出異常表達(dá)。其中，高血脂癥小鼠肝HMG-CoA red

10、uctase的激活伴隨著SREBF-2的激活。但是，高血脂癥小鼠肝中的7A羥化酶基因的表達(dá)沒(méi)有被激活。
　　 澤瀉和復(fù)方組都表現(xiàn)出膽固醇代謝有關(guān)的基因異常表達(dá)。在我們實(shí)驗(yàn)條件下，澤瀉和復(fù)方均降低了血清TC的水平，同時(shí)相應(yīng)的也激活了小鼠肝中HMG-CoA reductase表達(dá)。與澤瀉組相比，復(fù)方也激活了小鼠肝中SREBF-2的表達(dá)。但是，澤瀉和復(fù)方均小鼠肝中的CYP7α1基因的表達(dá)沒(méi)有被激活。
　　 白術(shù)對(duì)膽固醇代謝有關(guān)