用于食品的核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)是一種高度靈敏的分子診斷技術(shù)，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域具有十分重要的地位。但當(dāng)前的核酸擴(kuò)增技術(shù)在滿(mǎn)足結(jié)果準(zhǔn)確可靠的同時(shí)，一方面正在向操作簡(jiǎn)便、成本低廉、儀器簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速的方向發(fā)展，以實(shí)現(xiàn)樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè);另一方面又要求減少勞動(dòng)力參與、實(shí)現(xiàn)樣本的自動(dòng)化檢測(cè)、從而能夠同時(shí)檢測(cè)大量樣本。因此，迫切需要新的方法來(lái)滿(mǎn)足當(dāng)前核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的需求。為了開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速的食品安全檢測(cè)方法，本論文針對(duì)核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的不同模塊（核酸提取、核

2、酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)），分別開(kāi)發(fā)了不同的方法，主要研究?jī)?nèi)容、結(jié)果及相關(guān)結(jié)論如下:
　　(1)針對(duì)核酸提取步驟繁瑣，不便于大通量操作的問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了基于磁性微球的大米基因組DNA提取方法。該方法利用二氧化硅修飾的四氧化三鐵(Fe3O4@SiO2)磁性微球?qū)NA進(jìn)行提取，在以2％的月桂酰肌氨酸鈉(SLS)作為裂解液，5M的異硫氰酸胍(GITC)作為結(jié)合液提取DNA時(shí)具有最高的產(chǎn)率，且其提取的DNA與商業(yè)化Mag-Bind(R)Plant

3、DNA提取試劑盒提取的DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的循環(huán)閾值(Treshold cycle，Ct)相當(dāng);所建立的磁性微球提取方法分別用于從摻有不同含量轉(zhuǎn)基因成分的生米和熟米中提取DNA，并將提取到的DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，最低可檢測(cè)生米中0.01％轉(zhuǎn)基因成分及熟米中0.1％轉(zhuǎn)基因成分，且Ct值與轉(zhuǎn)基因成分含量的對(duì)數(shù)值具有良好的線性反相關(guān)關(guān)系(R2=0.998)，表明該方法提取的DNA純度能夠滿(mǎn)足熒光PCR的定量需求。綜上，所開(kāi)發(fā)的

4、磁性微球核酸提取方法操作簡(jiǎn)單、快速，提取的DNA樣本能夠滿(mǎn)足檢測(cè)需求。
　　(2)針對(duì)轉(zhuǎn)基因作物田間檢測(cè)樣品預(yù)處理需要操作快速簡(jiǎn)易及田間檢測(cè)供電困難的問(wèn)題開(kāi)發(fā)了無(wú)需供電設(shè)備參與，也無(wú)需對(duì)核酸樣本進(jìn)行純化的轉(zhuǎn)基因作物快速檢測(cè)方法，結(jié)果表明:使用0.5M NaOH對(duì)水稻葉片進(jìn)行4min處理后所得裂解液可直接用于LAMP擴(kuò)增(Tt=12.3);當(dāng)反應(yīng)溫度在51.9℃-66.6℃間時(shí)，陽(yáng)性樣本在40min內(nèi)都能被LAMP擴(kuò)增;三種保溫性能

5、不同的保溫杯作為熱源用于LAMP擴(kuò)增30min后，陽(yáng)性樣本的磷酸根離子顯色結(jié)果都為藍(lán)色;利用保溫性能最優(yōu)的保溫杯（將初始溫度為63℃的水35min內(nèi)保持在58℃以上）作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的熱源用于轉(zhuǎn)基因作物樣本檢測(cè)，其結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光PCR一致，且整個(gè)操作過(guò)程30min內(nèi)即可完成。綜上，使用0.5M NaOH對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行裂解，在不經(jīng)過(guò)核酸純化的前提下，利用保溫杯作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的熱源，結(jié)合磷酸根離子顯色法，即能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因作物的田間快速檢測(cè)。

6、該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速，不需要供電設(shè)備參與的優(yōu)點(diǎn)。
　　(3)以合成的單鏈DNA為模板，針對(duì)切刻酶恒溫?cái)U(kuò)增(NEAA)容易產(chǎn)生嚴(yán)重的非特異性擴(kuò)增的問(wèn)題，對(duì)NEAA反應(yīng)體系的溫度、切刻酶活性、Mg2+濃度等因素進(jìn)行了優(yōu)化;并以轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2為檢測(cè)對(duì)象，以基因組DNA上臨近切刻酶作用位點(diǎn)的序列作為待測(cè)目標(biāo)，利用不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增方法生成單鏈目標(biāo)產(chǎn)物，通過(guò)擴(kuò)增后添加抗原標(biāo)記的探針對(duì)單鏈產(chǎn)物進(jìn)行捕獲，并采用免疫橫向流動(dòng)試紙條(LF

7、D)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，建立了一種高度特異的NEAA產(chǎn)物檢測(cè)的方法;并開(kāi)發(fā)了一種可拋棄式的卡盒，能夠?qū)⒑怂釘U(kuò)增與LFD檢測(cè)過(guò)程全都整合在卡盒內(nèi)，擴(kuò)增結(jié)束后在不需要開(kāi)蓋操作的條件下即可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，有效避免擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠污染。該方法具有儀器簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、靈敏度商、特異性強(qiáng)、對(duì)抑制劑耐受性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用前景。
　　(4)針對(duì)熒光染料法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行可視化檢測(cè)具有很高背景信號(hào)的問(wèn)題，引入了納米材料消除

8、陰性樣本的背景信號(hào)，結(jié)果表明:氧化石墨烯(GO)、還原型氧化石墨烯(rGO)、二硫化鉬(MoS2)和二硫化鎢(WS2)這四種材料能夠消除利用SYBR GreenⅠ(SG)染料進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)的背景信號(hào)，從而增強(qiáng)檢測(cè)的信噪比;納米材料消除PCR背景信號(hào)的主要原因是吸附SG和引物;此外，利用納米材料能夠消除由于聚合酶過(guò)量而引起的非特異性擴(kuò)增;以轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2梯度稀釋的DNA作為樣本，利用所述方法進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度與實(shí)時(shí)熒光PC