新型ARB洗脫支架防治支架再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究及ILKAPs克隆與功能研究.pdf

1、背景:
　　經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)是目前治療冠心病的重要方法，但術(shù)后再狹窄問(wèn)題有待解決。新生內(nèi)膜過(guò)度生長(zhǎng)是再狹窄的主要原因，與血管平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)。血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑(ARB)能抑制內(nèi)膜增殖，可能是一種新的藥物選擇。藥物涂層支架(DES)是目前治療PCI后再狹窄的主要方法，常用DES包括雷帕霉素涂層支架(SES)和紫杉醇涂層支架(PES)。兩類支架并不能完全消除再狹窄，還會(huì)帶來(lái)支架內(nèi)血栓形成

2、。改進(jìn)支架設(shè)計(jì)、材料、涂層，尋找更合適的藥物是解決上述問(wèn)題的途徑。結(jié)合血管支架使用基因治療來(lái)調(diào)節(jié)局部組織細(xì)胞功能是一個(gè)潛在的方法，但是有關(guān)的影響因素和分子機(jī)理是該方法進(jìn)入臨床研究前必須明確的問(wèn)題。
　　目的:
　　為指導(dǎo)臨床改進(jìn)DES用藥，我們比較血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑纈沙坦與替米沙坦對(duì)離體人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)增殖及膠原分泌的影響并探討其可能的機(jī)制。進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討替米沙坦涂層、纈沙坦涂層和雷帕霉素支

3、架對(duì)支架術(shù)后內(nèi)膜增殖的作用差別。探討影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)的蛋白sp100的相互作用蛋白，并對(duì)可能影響血管支架局部細(xì)胞反應(yīng)的ILKAPs進(jìn)行基因克隆和功能研究。
　　材料與方法:
　　比較不同濃度的及條件的AngⅡ、纈沙坦、替米沙坦、GW9662干預(yù)HASMCs的效果。觀察處理后細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞上清中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量，細(xì)胞AT1、AT2受體蛋白表達(dá)，Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA水平。進(jìn)一步選取28只實(shí)驗(yàn)用豬，隨機(jī)置入替米沙坦涂層(TES)

4、、纈沙坦涂層(VES)、雷帕霉素支架(SES)和高分子涂層支架(PES)。分別于1周、1月和3月分別處死，處死前進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影(CAG)、光學(xué)相干成像(OCT)檢查。通過(guò)酵母雜交分析影響基因治療效果的SP100的相互作用蛋白組成。從中選取可能影響局部細(xì)胞增殖的ILKAP作表達(dá)譜，基因結(jié)構(gòu)和異構(gòu)體組成分析。并且通過(guò)亞細(xì)胞定位、過(guò)表達(dá)與低調(diào)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響來(lái)探討ILKAPs的功能。
　　結(jié)果:
　　纈沙坦及替米沙坦均

5、可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HASMCs增殖。替米沙坦的抑制作用較纈沙坦強(qiáng)。纈沙坦及替米沙坦均可抑制AT1受體、促進(jìn)AT2受體表達(dá)，替米沙坦促進(jìn)AT2受體表達(dá)能力更強(qiáng)。纈沙坦及替米沙坦均抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)，替米沙坦抑制Ⅲ型膠原能力較纈沙坦更強(qiáng)。PPAR-γ抑制劑GW9662可拮抗吡格列酮對(duì)HASMCs增殖的抑制作用，但對(duì)替米沙坦抑制HASMCs增殖的作用無(wú)明顯影響。纈沙坦及替米沙坦對(duì)HASMCsⅠ、Ⅲ型膠原的分泌無(wú)明顯影響。

6、　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1周組共5只豬，隨訪支架13枚。TES、VES、SES和PES較BMS直徑狹窄率低。1月組共12只豬，隨訪支架29枚。CAG結(jié)果顯示TES、VES、SES和PES間MLD和直徑狹窄率均有明顯差異，其中TES、VES、SES的MLD明顯高于PES，直徑狹窄率明顯低于PES; TES、VES的MLD低于SES，并且TES的MLD高于VES; TES、VES的直徑狹窄率高于SES，并且TES的直徑狹窄率明顯低于VES。OCT檢查結(jié)

7、果顯示TES、VES、SES的新生內(nèi)膜厚度明顯低于PES，面積狹窄率明顯低于PES，TES、VES的新生內(nèi)膜厚度高于SES，并且TES的新生內(nèi)膜厚度明顯低于VES; TES、VES的面積狹窄率高于SES，并且TES的面積狹窄率明顯低于VES。3月組共11只豬，隨訪支架31枚。CAG結(jié)果顯示TES、VES、SES和PES間MLD和直徑狹窄率均有明顯差異，其中TES、VES、SES的MLD明顯高于PES，直徑狹窄率明顯低于PES; TES、

8、VES的MLD低于SES，并且TES的MLD高于VES; TES、VES的直徑狹窄率高于SES，并且TES的直徑狹窄率明顯低于VES。OCT檢查結(jié)果顯示TES、VES、SES的新生內(nèi)膜厚度明顯低于PES，面積狹窄率明顯低于PES，TES、VES的新生內(nèi)膜厚度高于SES，并且TES的新生內(nèi)膜厚度明顯低于VES; TES面積狹窄率低于SES和VES。
　　酵母雜交分離到64個(gè)潛在的SP100相互作用克隆。其中有ILKAP的一個(gè)新異構(gòu)體

9、出現(xiàn)兩次。使用ILKAP ORF特異性引物，我們擴(kuò)增胎腦cDNA文庫(kù)，從中分離到3個(gè)異構(gòu)體:ILKAP1，ILKAP2和ILKAP3。其中ILKAP1含有兩個(gè)磷酸酶活性域，ILKAP3含有一個(gè)磷酸酶活性域，而ILKAP2僅僅只有一個(gè)N端結(jié)構(gòu)域，沒(méi)有磷酸酶活性域。掃描多組織cDNA pannels發(fā)現(xiàn)ILKAP2和ILKAP3僅僅在胎腦有較高水平表達(dá)。ILKAP3也見(jiàn)于表達(dá)于人類心臟。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)ILKAP1-3均定位于細(xì)胞質(zhì)，與I

10、LK具有細(xì)胞內(nèi)共分布特性。提示其存在相互作用的空間可能性。免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)抗GFP的抗體可以沉淀同時(shí)表達(dá)GFP-ILK的細(xì)胞中的三種ILKAPs。過(guò)表達(dá)ILKAP1、3可以導(dǎo)致細(xì)胞劃痕愈合時(shí)間延長(zhǎng)。使用ILKAP特異性shRNA低調(diào)細(xì)胞ILKAP表達(dá)則可以加快劃痕愈合。
　　結(jié)論:
　　替米沙坦具有比纈沙坦更強(qiáng)的抑制HASMCs增殖、抑制Ⅲ型膠原基因表達(dá)及促進(jìn)AT2受體表達(dá)上調(diào)的作用。
　　TES在抑制內(nèi)膜增殖方面與