高通量定量比較細(xì)胞裂解液中未純化融合酶比活性的方法及其應(yīng)用.pdf

1、6-His標(biāo)簽與酶及其突變體融合表達(dá)后，可用ELISA原理或磁分離原理在固定親和分離介質(zhì)的量的基礎(chǔ)上，通過預(yù)測(cè)親和分離介質(zhì)對(duì)融合酶的最大吸附量推算比活性等效量Vs，高通量定量比較酶及其突變體的比活性。該方法能夠有效地克服克隆接種量、誘導(dǎo)表達(dá)效率、細(xì)胞裂解效率等的差異對(duì)裂解液中融合酶比活性的影響，盡量避免了假陽性突變體的出現(xiàn)。更關(guān)鍵的是，可以應(yīng)用于定量測(cè)定細(xì)胞裂解液中的未純化標(biāo)簽融合酶及其突變體的比活性，更有效的避開融合酶在純化過程面臨的

2、技術(shù)、成本和勞動(dòng)挑戰(zhàn)，為酶突變體庫的高通量篩選提供了快速、高效的方法。該方法建立需一個(gè)適合比活性的融合酶或突變體作為突變體設(shè)計(jì)的起始酶;一組適合的標(biāo)簽與親和分離介質(zhì)作為吸附分離實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。本文首先建立定量測(cè)定細(xì)胞裂解液中未純化融合酶及其突變體比活性的新方法。
　　1.高通量定量比較細(xì)胞裂解液中未純化融合酶比活性方法的建立
　　在測(cè)定室中的實(shí)驗(yàn)，利用的是親和分離介質(zhì)與細(xì)胞裂解液中的肽標(biāo)簽融合酶或其突變體所帶標(biāo)簽的特異性結(jié)合。固

3、定測(cè)定室中親和分離介質(zhì)的量，則每個(gè)測(cè)定室所能結(jié)合的最大蛋白量是與親和分離介質(zhì)對(duì)標(biāo)簽結(jié)合容量直接相關(guān)的數(shù)據(jù)。理論上，相同的親和介質(zhì)、相同的包被量，測(cè)定室中所能結(jié)合的肽標(biāo)簽量是相同即最大吸附量N，此時(shí)所測(cè)定出不同酶的活性Vs則是用來比較比活性最有價(jià)值的數(shù)據(jù)。當(dāng)吸附結(jié)合量達(dá)到N時(shí)，即使不斷增大測(cè)定室的蛋白量，反應(yīng)速度V也不會(huì)再繼續(xù)在增大，這時(shí)候測(cè)定室反應(yīng)速度即是該酶的最大比活性（Vs）。但是，在實(shí)際操作中，要達(dá)到親和介質(zhì)吸附的飽和化，除需要較

4、大的蛋白量外，還會(huì)帶來在活性測(cè)定中出現(xiàn)的反應(yīng)速度過快的弊端。為解決這一點(diǎn)，通過跟蹤吸附結(jié)合后的反應(yīng)速度（V）與測(cè)定室中結(jié)合蛋白量--Quantity of Protein（μg）的響應(yīng)曲線用雙倒數(shù)法或是Matlab曲線擬合的方式來預(yù)測(cè)融合酶在測(cè)定室中的最大吸附容量(N)從而定量計(jì)算其比活性（Vs）。實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)ELISA原理與磁分離技術(shù)，我們可以同時(shí)對(duì)多個(gè)突變體的多個(gè)測(cè)定室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，實(shí)現(xiàn)高通量模式下的比較?；陔臉?biāo)簽與親和分離介質(zhì)

5、的可逆結(jié)合，建立對(duì)該可逆結(jié)合平衡的化學(xué)計(jì)量學(xué)新的分析方法。該方法不需要肽標(biāo)簽融合酶及其突變體的純樣品，其過程本身就是對(duì)加入測(cè)定室的樣品的純化、分離，最終測(cè)定的反應(yīng)速度Vs即是純酶的比活性，這為細(xì)胞裂解液中的未純化融合酶活性的比較提供了一種新的行之有效的方法。
　　2.預(yù)測(cè)和定量比較6-His-羧酸酯酶及其突變體的比活性:mcAb為親和分離介質(zhì)
　　通過基因全合成及突變體的構(gòu)建得到一組融合6-His標(biāo)簽的羧酸酯酶及其突變體M3

6、26L，并以mcAb作為固定用親和分離介質(zhì)，利用ELISA原理，在高通量模式下對(duì)融合酶及其突變體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白濃度和表觀比活性的測(cè)定，并應(yīng)用本方法對(duì)融合酶及其突變體的細(xì)胞裂解液進(jìn)行定量活性比較。通過雙倒數(shù)曲線預(yù)測(cè)Vs得到Est(1)與M326L的相對(duì)比活性值為3.0±0.2，CV≤10％(n≥5)，對(duì)比多批次誘導(dǎo)表達(dá)以及Matlab的正態(tài)性分析，得到二者的活性比值:在250ml與4ml培養(yǎng)基中分別為3.0±0.5，CV≥18％(n1

7、=25，n2=11)和3.2±1.3，CV≥40％(n1=122，n2=35)。該應(yīng)用中，抗體的用量為0.6μg即可滿足要求，雖然其選擇性較高，但親和力不足，蛋白的用量甚至需要達(dá)到200μg以上，才能較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)和比較，因此用于酶突變體庫的的初篩收到樣品量和成本的限制。當(dāng)然，本方法樣品為細(xì)胞裂解液上清，在準(zhǔn)確性相對(duì)提高的同時(shí)，又使得比活性的測(cè)定不需要通過蛋白純化這種復(fù)雜的過程，尤其適用于酶穩(wěn)定性隨溫度、表面活性劑、金屬離子等敏感改變的酶

8、。即使同一酶的不同細(xì)胞裂解液由于其他因素導(dǎo)致的表觀比活性差異可達(dá)到5倍以上時(shí)，只要在吸附分離過程中使得數(shù)據(jù)滿足:Vmin≥0.090，Vmax≤1.800;最低稀釋濃度點(diǎn)的抗體結(jié)合率在40％以上，本方法亦可有效預(yù)測(cè)Vs且CV值在10％以下，雙倒數(shù)曲線的相關(guān)系數(shù)R2≥0.95。
　　3.預(yù)測(cè)和定量比較6His-大腸桿菌堿性磷酸酶及其突變體的比活性:Ni-NTA為親和分離介質(zhì)
　　在以ECAP與R167K作為應(yīng)用模型試驗(yàn)中，仍以

9、6-His標(biāo)簽與酶及其突變體融合表達(dá)。ECAP與R167K用Ni-NTA純化后獲得較好的純化效果，能相對(duì)準(zhǔn)確得測(cè)得二者比活性的相對(duì)值為1.75±0.08CV≤5％(n=3);采用本文建立的方法，用Matlab曲線擬合的方式預(yù)測(cè)Vs并得到ECAP與R167K的相對(duì)比活性值為1.73±0.14，CV≤10％(n=3)，R2≥95％，與純化后所得標(biāo)簽融合酶及其突變體的比活性比值僅相差不到3％，比較通過多批次誘導(dǎo)表達(dá)得到二者的活性比值:在4ml

10、培養(yǎng)基條件下為1.2±0.3，且CV≥20％(n1=n2=13)。進(jìn)一步說明本方法在定量比較細(xì)胞裂解液中未純化標(biāo)簽融合酶及其突變體的比活性方面的意義。該應(yīng)用中使用親和分離介質(zhì)是Ni-NTA磁珠，我們可以根據(jù)酶比活性的高低，通過調(diào)整EP管中參與吸附分離反應(yīng)的Ni-NTA磁珠的量以及酶促反應(yīng)時(shí)間來控制反應(yīng)速度。使用Ni-NTA磁珠量為25μg時(shí)，總蛋白上樣量在1μg至20μg左右即可有效預(yù)測(cè)其在EP管中的最大吸附量(N)，避免了雜蛋白對(duì)吸附

11、分離的影響，當(dāng)表達(dá)豐度P≥3％的時(shí)候，該方法便準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和測(cè)定酶的比活性Vs。當(dāng)然要注意的一點(diǎn)就是:雙倒數(shù)曲線應(yīng)用的條件是測(cè)定室中融合酶或其突變體的總量n應(yīng)是該測(cè)定室親和分離介質(zhì)的最大吸附量N的20倍或以上。由于在該應(yīng)用中所使用的蛋白量很低，因此不滿足雙倒數(shù)法進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析的要求，取而代之的是Matlab的曲線擬合方法，仍是具有重要意義的。由于Ni-NTA磁珠的親和力較mcAb高得多，但選擇行卻不及mcAb，故在實(shí)驗(yàn)操作過程中，蛋白質(zhì)的用

12、量更需要精心的控制。就整個(gè)操作而言，Ni-NTA磁珠的吸附分離反應(yīng)更適用于突變體的確認(rèn)，卻不適合于突變體庫的初篩。以Ni-NTA為親和分離介質(zhì)時(shí)整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程僅為2h較mcAb的26h的耗時(shí)過程，大大降低實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，即使對(duì)溫度比較敏感的酶，也可得到較好地應(yīng)用，因此更具有優(yōu)勢(shì)。
　　該方法應(yīng)用于突變體庫的建立及高通量篩查中的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)適合活性的肽標(biāo)簽融合酶作為突變體庫建立的起始酶。根據(jù)酶活性的高低選擇合適的親和介質(zhì)固定量、樣品蛋白的