快速靈敏檢測(cè)熱原的穩(wěn)定細(xì)胞系的開發(fā)與研究.pdf

1、熱原是一類在宿主體內(nèi)可以引起發(fā)熱和誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的異構(gòu)類化合物。在臨床上，熱原是指能使哺乳動(dòng)物產(chǎn)生熱原反應(yīng)的物質(zhì)。熱原按照來源分為外源性熱原和內(nèi)源性熱原。外源性熱原主要來源于機(jī)體外，分別為微生物（如細(xì)菌、病毒、真菌）與非微生物（如抗原、抗腫瘤藥）性熱原，內(nèi)源性熱原主要包括機(jī)體內(nèi)的激素（如類固醇、前列腺素）與細(xì)胞因子（如腫瘤壞死因子、干擾素、生長(zhǎng)因子、白介素）。使用熱原污染的藥品和醫(yī)療器械會(huì)引起系統(tǒng)性炎癥，在最糟糕的情況下，則會(huì)引起敗血性休

2、克。因此，準(zhǔn)確和快速量化熱原對(duì)藥品安全是至關(guān)重要的。到目前為止，家兔法、鱟試劑法和單核細(xì)胞激活試驗(yàn)檢測(cè)法對(duì)于熱原的檢測(cè)都存在限制。在我們的研究中，我們致力于開發(fā)一種利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來靈敏、可靠、快速地檢測(cè)熱原的方法。
　　先前的報(bào)道已經(jīng)表明，細(xì)菌鞭毛蛋白可以通過Toll樣受體TLR5刺激人肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-8。然而，其他的熱原物質(zhì)是如何誘導(dǎo)激活肺上皮細(xì)胞還沒有完全被闡釋清楚。脂多糖（LPS，也被稱為內(nèi)毒素）作為最主

3、要的熱原，是細(xì)胞因子最有效的細(xì)菌誘導(dǎo)劑之一。在感染過程中，熱原刺激人的單核細(xì)胞去合成或者釋放炎癥細(xì)胞因子，包括白介-1β，白介-6，腫瘤壞死因子-α。而NF-κB是調(diào)控編碼這些促炎因子基因的主要轉(zhuǎn)錄因子。與此同時(shí)，人類β-干擾素(IFN-β)通過增強(qiáng)TNF依賴的TNF的產(chǎn)生，顯著性增加了正常家兔對(duì)內(nèi)毒素的發(fā)熱反應(yīng)，而且也恢復(fù)了致敏原耐受的家兔對(duì)內(nèi)毒素的正常發(fā)熱反應(yīng)。鑒于此，我們把含有NF-κB應(yīng)答元件或者IFN-β啟動(dòng)子的熒光素酶基因插

4、入到慢病毒載體中，然后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，再經(jīng)過流式分選單克隆，最后利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來鑒定單克隆細(xì)胞的活性，從而構(gòu)建出穩(wěn)定的人A549熒光素酶報(bào)告細(xì)胞系。
　　我們的結(jié)果表明幾株NF-κB單克隆穩(wěn)定細(xì)胞對(duì)0.1EU/mL的內(nèi)毒素響應(yīng)，而這是少于人的發(fā)熱閾值0.3EU/mL內(nèi)毒素的。我們進(jìn)一步使用靈敏度為0.125EU/mL的鱟試劑與報(bào)告細(xì)胞比較，這是藥物中廣泛使用的鱟試劑靈敏度，以評(píng)估相同條件下的熱原，結(jié)果顯示報(bào)告細(xì)胞達(dá)