小檗堿對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響及其與ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　以ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7，構(gòu)建巨噬細(xì)胞泡沫化模型，研究小檗堿對(duì)泡沫細(xì)胞形態(tài)學(xué)、脂質(zhì)含量、氧化應(yīng)激和和炎癥反應(yīng)的影響，并探討其作用機(jī)制是否與ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸相關(guān)。
　　方法:
　　1.建立巨噬細(xì)胞泡沫化模型:分別用20、40、60、80μg·ml-1ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞泡沫化，油紅O染色觀察泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積變化，測OD值定量分析泡沫細(xì)胞內(nèi)脂滴含量，確定

2、ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7泡沫化的最佳濃度。
　　2.分別用1，2.5，5，10，20，40，80μM小檗堿處理小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.724h、48h和72h，MTT法檢測小檗堿對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組:
　　對(duì)照組:細(xì)胞正常培養(yǎng);
　　模型組:用60μg·ml-1ox-LDL作用24h誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化;
　　加藥組:分別用2.5，5，10μM小檗堿和60μg·ml-1ox-LD

3、L共同處理巨噬細(xì)胞24h。
　　4.油紅O染色觀察小檗堿對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化形態(tài)的影響，并測OD值定量分析泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量變化。
　　5.測定總膽固醇(TC)和膽固醇酯(CE)含量，以CE/TC比值判斷小檗堿對(duì)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響。
　　6.化學(xué)比色法檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)與谷胱甘肽(GSH)的含量。
　　7.ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量，化學(xué)比色法檢測一氧化氮

4、(NO)的含量。
　　8.Real-time PCR法檢測ACE2、MAS受體mRNA的表達(dá)。
　　9.ELISA法檢測Ang-(1-7)的含量。
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度ox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞24h，油紅O染色可見巨噬細(xì)胞變大、變圓，胞漿內(nèi)脂滴含量呈劑量依賴性增加。
　　2.MTT法檢測小檗堿呈時(shí)間-劑量依賴性抑制RAW264.7細(xì)胞增殖。
　　3.不同濃度小檗堿處理泡沫細(xì)胞后，油

5、紅O染色陽性細(xì)胞逐漸減少，且呈劑量依賴性減少胞漿內(nèi)脂滴及膽固醇含量。
　　4.與對(duì)照組比較，模型組中MDA含量顯著增加(P＜0.01)，SOD和GSH含量顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);與模型組比較，加藥組中MDA含量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），SOD和GSH含量顯著增加(P＜0.05, P＜0.01)。
　　5.與對(duì)照組比較，模型組中TNF-α和NO含量顯著增加(P＜0.01);與模型組比較，加藥組中T

6、NF-α和NO含量顯著減少(P＜0.01)。
　　6.Real-time PCR結(jié)果顯示，模型組ACE2和MASmRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著減少(P＜0.01);小檗堿處理后，能明顯增加ACE2和MAS mRNA表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)。
　　7.ELISA法檢測Ang-(1-7)的含量顯示，模型組Ang-(1-7)含量較對(duì)照組顯著上升(P＜0.01)，加藥組中小檗堿呈濃度依賴性增加Ang-(1-7)的含量(P＜0