兒童急性呼吸道感染病毒流行特征與基因特征研究.pdf

1、背景:
　　 急性呼吸道感染(acuterespiratorytractinfection，ARTI)是在全球范圍內(nèi)人類最常見的傳染性疾病之一，發(fā)病率居急性傳染病的首位，平均每年下呼吸道感染導(dǎo)致大約4，000，000患者死亡。近些年來，非典、H5N1禽流感、豬流感、新型冠狀病毒以及新出現(xiàn)的感染人的H7N9禽流感，讓人類對(duì)呼吸道病毒性傳染病的關(guān)注上升到一個(gè)前所未有的高度。ARTI也是威脅兒童健康的主要因素，造成每年大約2，000，

2、000兒童死亡，已成為5歲以下兒童死亡的第二大病因，同時(shí)也是兒童主要的公共健康問題之一。面對(duì)當(dāng)前呼吸道傳染病防治的復(fù)雜形勢(shì)，加強(qiáng)傳染病疫情信息的監(jiān)測(cè)報(bào)告和在人群巾，尤其是兒童中，主動(dòng)開展呼吸道病毒性病原體實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)，最大可能地對(duì)呼吸道傳染病疫情進(jìn)行預(yù)測(cè)預(yù)警，以期在疫情暴發(fā)流行早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)并采取快速的應(yīng)對(duì)措施，減少對(duì)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的影響。
　　 目的:
　　 本研究在2009～2012年對(duì)ARTI兒童開展呼吸道病毒性病原體

3、監(jiān)測(cè)，主要包括呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)、鼻病毒(humanrhinovirus，HRV)、流感病毒(influenzavirus，IFV)、偏肺病毒（metapneumovirus，MPV），副流感病毒(parainfluenzavirus，PIV)、人類博卡病毒(humanbocavirus，HBoV)，人冠狀病毒(humancoronavirus，HCoV)、人腺病毒(humana

4、denovirus，HAdV)，腸道病毒(humanenterovirus，HEV)，描繪在ARTI兒童中呼吸道病毒性病原體的病原譜和流行特征;分析呼吸道病毒在肺炎兒童和哮喘發(fā)作兒童中的分布情況以及與重癥的關(guān)系;分析呼吸道病毒在ARTI兒童中陽(yáng)性檢出率與氣象因素的關(guān)系;了解呼吸道病毒之間以及呼吸道病毒與細(xì)菌之間的共生關(guān)系。
　　 本研究分析HAdV、HRV、HEV以及HBoV全基因組或某些基因片段變異進(jìn)化特征，尤其是新發(fā)或再發(fā)的

5、病毒亞型，主要包括HAdV-7、HAdV-55、HRV-C、HEV-68、HEV-118和HBoV-1。通過對(duì)病毒基因特征的分析，了解該病毒的起源、進(jìn)化、流行株及耐藥等信息，從而為病毒感染治療、疫苗研究和疫情控制提供科學(xué)依據(jù)和參考意見，進(jìn)而保障人民生命健康安全，促進(jìn)社會(huì)安定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。
　　 材料與方法:
　　 以重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院作為監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院，從2009年6月到2012年5月在呼吸內(nèi)科開展急性呼吸道感染病例標(biāo)

6、本收集和呼吸道傳染病監(jiān)測(cè)。研究人員在ARTI兒童入院當(dāng)天采集鼻咽抽吸物標(biāo)本并使用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)問卷，收集病例信息。
　　 本研究共檢測(cè)9種病毒性病原體，根據(jù)不同病原體采用相應(yīng)的檢測(cè)方法。IFV和HRV/HEV采用Real-TimePCR檢測(cè);RSV、PIV、HCoV、MPV和HBoV采用巢式PCR檢測(cè);HAdV則使用單輪PCR檢測(cè)。HAdV陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增測(cè)定hexon基因和fiber基因序列，并測(cè)定了HAdV-55全基因組序列。HRV陽(yáng)

7、性標(biāo)本擴(kuò)增測(cè)定VP4/2基因序列，HEV擴(kuò)增測(cè)定5'NTR序列和VP1基因序列。HBoV陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增測(cè)定全基因組序列。
　　 基因序列分析主要包括同源性分析、系統(tǒng)發(fā)育分析、重組分析、分子鐘分析、選擇壓力分析和空間動(dòng)力學(xué)分析。調(diào)查表數(shù)據(jù)使用EpiData3.0錄入，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均采用SAS9.3軟件處理。
　　 結(jié)果:
　　 1.呼吸道病毒概況
　　 (1)本研究共納入因ARTI住院的兒童2

8、451例，RSV陽(yáng)性標(biāo)本檢出率最高，為36.7％，其余依次為PIV23.3％、IFV19.6％、HRV/HEV18.4％、HBoV14.1％、HAdV7.9％、MPV3.4％和HCoV3.1％。至少一種呼吸道病毒陽(yáng)性檢出率為80.3％。單一呼吸道病毒感染率為45.2％。復(fù)合感染病毒陽(yáng)性標(biāo)本861例，復(fù)合感染率為35.2％。
　　 (2)IFV在各年齡組均有較高的感染率，但與＜6個(gè)月年齡組比，其他各年齡組感染率稍高，是其1.5～2

9、倍。在≤5歲的兒童中，HAdV感染率隨年齡增大而逐漸增大。男孩比女孩更容易感染IFV-B和HRV/HEV，OR分別為2.19(95％CI:1.16-4.14)和1.28(95％CI:1.02-1.59)。ARTI兒童臨床癥狀和體征主要包括發(fā)熱、咳嗽、咳痰、腹瀉，肺部濕羅音和呼吸增快。RSV-A容易導(dǎo)致呼吸困難（28.2％，P＜0.001），而RSV-B容易導(dǎo)致較多的咳痰(88.1％，P＜0.001)。IFV-A感染導(dǎo)致白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低（P

10、＜0.05）;RSV和PIV-3感染導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞百分比減少和淋巴細(xì)胞百分比和血小板計(jì)數(shù)增高(P＜0.05)。
　　 (3)在HAdV感染的兒童中，嗜中性粒細(xì)胞百分比升高，淋巴細(xì)胞百分比降低，血小板計(jì)數(shù)也降低(P＜0.05)。
　　 (4)Logistic回歸模型結(jié)果表明，與無呼吸道病毒感染相比，呼吸道病毒感染未增高肺炎發(fā)生幾率。RSV和HAdV感染較容易引起重癥肺炎(OR=1.58，95％CI:1.08-2.30;O

11、R=5.10，95％CI:3.17-8.21)。與無呼吸道病毒感染相比，RSV-B、IFV-A和HRV/HEV容易引發(fā)哮喘中重度發(fā)作，OR值分別為2.99(95％CI:1.28-6.97)、2.28(95％CI:1.01-5.15)和2.94(95％CI:1.35-6.41)。
　　 (5)呼吸道病毒之間和呼吸道病毒與細(xì)菌感染之間的相關(guān)系數(shù)Rij均小于0.30，表明呼吸道病毒之間、病毒與細(xì)菌感染并不存有共生或抑制關(guān)系。RSV與月

12、平均氣溫、大氣壓以及太陽(yáng)光照時(shí)數(shù)相關(guān)度強(qiáng)，而其他呼吸道病毒與氣象因素相關(guān)度均在中度以下，表明重慶地區(qū)氣象因素對(duì)除RSV以外的呼吸道病毒流行影響較小。
　　 2.人腺病毒亞型分布及基因特征
　　 (1)在重慶地區(qū)，HAdV亞型主要包括HAdV-7型48.7％、HAdV-3型37.3％和HAdV-55型3.1％;其次還有HAdV-5型2.6％、HAdV-1型2.1％和HAdV-2型0.5％。
　　 (2)在2010年

13、7月～2011年6月期間HAdV陽(yáng)性檢出率較高。在2010年8月之前，HAdV-3為優(yōu)勢(shì)亞型;而從2010年9月開始，HAdV-7演變?yōu)檎贾鲗?dǎo)地位的HAdV亞型。HAdV-7引起的臨床癥狀比例高，尤其以呼吸困難與濕羅音為最高（P＜0.05），并且住院時(shí)間較其他亞型長(zhǎng)（P=0.002）。各亞型復(fù)合感染率從45.7％到100％不等，以HAdV-7為最低(P=0.044)。HAdV-7引起重癥疾病的幾率是HAdV-3的3.52倍(45.7％v

14、s.18.1％，95％CI:1.60-7.74，P=0.002)。
　　 (3)重慶地區(qū)HAdV-7型主要以7d2為主。HAdV-7型hexon基因序列同源性均在99.8％～100％。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示重慶地區(qū)hexon基因序列主要分布在7d2和7d兩個(gè)分支。7d分支更容易引起重癥肺炎(OR=2.50，95％CI:1.05-5.94)。HAdV-7型fiber基因同源性在99.7％～100％，存在兩個(gè)基因位點(diǎn)的改變:C111T和A

15、253G。A253G位點(diǎn)儀出現(xiàn)在CQ1243和CQ1379，造成了氨基酸Thr85GLA改變。
　　 (4)HAdV-3型hexon基因序列形成多個(gè)分支，呈現(xiàn)地域差異，但同時(shí)存在地域之間的傳播。HAdV-3型fiber基因序列4個(gè)堿基變異位點(diǎn):T520C(CQ5685)、A567C、C722A(CQ5)和G742A(CQ483)。其中，A567C位點(diǎn)變異在多株中出現(xiàn)，但未引起氨基酸位點(diǎn)變異;而C722A位點(diǎn)和G742A位點(diǎn)使氨基

16、酸位點(diǎn)發(fā)生了改變:Pr0261His和Glu278Lys。系統(tǒng)發(fā)育樹形成三個(gè)分支，重慶地區(qū)序列均位于A支，遺傳距離較近，序列較穩(wěn)定。
　　 (5)本研究成功擴(kuò)增3株HAdV-55基因組全序，與其他HAdV-55之間同源性在99.8‰99.9％;與HAdV-B2同源性在96.1％～98.7％，以與HAdV-14同源性最高。系統(tǒng)發(fā)育分析表現(xiàn)為HAdV-55基因序列具有地域特征。我國(guó)地區(qū)流行的HAdV-55顯示有HAdV-14特征。我

17、國(guó)HAdV-55分歧時(shí)間大約在1992年，其中CQ814、CQ1657、CQ2903、Hebei/BD/2012隨時(shí)間依次分化，而Shaanxi/QSDLL/2006分化與CQ1657同時(shí)出現(xiàn)。大陸和臺(tái)灣地區(qū)hexon基因分歧時(shí)間大約在1997年，我國(guó)大陸內(nèi)分歧時(shí)間則更近一些，大約在2005年。我國(guó)大陸與新加坡fiber序列分歧時(shí)間大約在2004年，與臺(tái)灣地區(qū)分歧時(shí)間在2001年左右。
　　 3.鼻病毒和腸道病毒
　　

18、(1)在1564份標(biāo)本中，共檢出HRV陽(yáng)性標(biāo)本223(14.3％)例，包括HRV-A型120(53.8％)例，HRV-B型11(4.9％)例和HRV-C型92(41.3％)例;同時(shí)檢出HEV41(2.6％)份，主要包括HEV-687(17.1％)例，HEV-71和CV-A6各5(12.2％)例。
　　 (2)重慶地區(qū)HRV-C型以HRV-C2為主，其次依次為HRV-C43、HRV-C1和HRV-C17。此外，尚有5條VP4/2基

19、因序列與已知的51個(gè)亞型基因序列同源性差異超過10％，本研究暫時(shí)命名為HRV-C52，HRV-C53和HRV-C54。分子鐘分析發(fā)現(xiàn)HRV-C型VP4/2基因序列整體進(jìn)化速率為6.9×10-3s/s/y（95％HPD:2.5×10-3～12.5×10-3s/s/y）。重慶地區(qū)所有HRV-C型基因序列在分子鐘樹中分為兩支，兩支的分化時(shí)間大約為113年前。從BSP可以看出大約在40年前，人群中有效感染人數(shù)出現(xiàn)了大幅度的上升。
　　

20、(3)分子鐘分析表明HEV-68VP1基因序列整體進(jìn)化速率為9.6×10-3s/s/y（95％HPD:6.9×10-3～12.5×10-3s/s/y）。系統(tǒng)發(fā)育樹包括三個(gè)分支，Lineage3中國(guó)分支大約在1973年與其他分支分化，以較高的進(jìn)化速率進(jìn)化（3.2×10-2s/s/y，95％HPD:2.1×10-2～4.7×10-2s/s/y），直到2008年進(jìn)化速率恢復(fù)到正常水平。選擇壓力分析發(fā)現(xiàn)VP1基因片段未發(fā)現(xiàn)正選擇位點(diǎn)，HEV-6

21、8主要通過純化選擇方式進(jìn)化。BSP表明HEV-68有效感染人數(shù)在2～4年前出現(xiàn)了短暫的上升，在1998年前保持平穩(wěn)。空間動(dòng)力學(xué)分析表明日本山形省和美國(guó)德克薩斯州是HEV-68遷移的地域源頭。
　　 (4)首次檢測(cè)到HEV-118在中國(guó)ARTI兒童中存在，其基因序列與HEV-109和HEV-104高度同源。HEV-118中國(guó)株VP1基因序列與以色列ISR10株同源性為97％，與秘魯PER161株(JX393301)同源性為91％。

22、HEV-118分支進(jìn)化速率為3.6×10-3s/s/y(95％HPD:1.2×10-3～6.7×10-3s/s/y)，與HEV-109分歧時(shí)間大約在168年前。
　　 4.人博卡病毒
　　 (1)重慶地區(qū)HBoV全基因組序列同源性為99.4％～100％。其中，HBoV-1各個(gè)基因片段序列同源性均高于97％。從同源性分析可以看出HBoV-1基因序列穩(wěn)定保守。
　　 (2)HBoV全基因組序列和各基因片段構(gòu)建的樹基本

23、一致，在HBoV-1分支內(nèi)并沒有出現(xiàn)Bootstrap值＞750的分支，推測(cè)HBoV-1基因序列不具有時(shí)空分布特征。
　　 (3)HBoV-I進(jìn)化速率為1.89×10-4s/s/y(95％HPD:0.01～4.54×104s/s/y)，低于HBoV整體進(jìn)化速率。選擇壓力分析發(fā)現(xiàn)VP1基因第40位點(diǎn)為正選擇位點(diǎn)，而NP、NS和VP2未發(fā)現(xiàn)正選擇位點(diǎn)。
　　 結(jié)論:
　　 1.呼吸道病毒流行特征
　　 (1)

24、在ARTI兒童中，呼吸道病毒感染率為80.3％，是引起兒童ARTI最主要的病原體。RSV在ARTI兒童中陽(yáng)性檢出率最高，其余依次為PIV、IFV、HRV/HEV和HBoV。重慶地區(qū)在2010～2011年期間兒童中可能出現(xiàn)過HAdV暴發(fā)。
　　 (2)RSV和HAdV感染易引發(fā)重癥肺炎，而RSV-B、IFV-A和HRV/HEV與哮喘中重度發(fā)作有關(guān)。
　　 2.人腺病毒
　　 (1)HAdV在急性呼吸道感染的兒童中存

25、在多個(gè)亞型流行，以HAdV-7、HAdV-3和HAdV-55為主;HAdV-7較HAdV-3以及其他亞型更容易引起重癥肺炎。
　　 (2)HAdV-7和HAdV-3hexon基因和fiber基因序列比較穩(wěn)定和保守，具有地域特征;其中，HAdV-7hexon基因主要以7d和7d2存在，7d與重癥疾病有關(guān)。HAdV-55全基因組序列變異較大，具有空間和時(shí)間的進(jìn)化特性。
　　 3.鼻病毒和腸道病毒
　　 (1)HRV主

26、要以A型和C型為主;而HRV-C又以C2型為主。此外發(fā)現(xiàn)并命名三個(gè)新亞型:C52～C54。
　　 (2)首次在中國(guó)急性呼吸道感染兒童中檢出HEV-68;系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)中國(guó)存有多個(gè)分支，并且在38年前形成一個(gè)新的分支，具有較高的進(jìn)化速率;HEV-68在世界范圍內(nèi)存在遷移現(xiàn)象。
　　 (3)首次獲得HEV-118全基因組序列，通過對(duì)VP1基因序列分析發(fā)現(xiàn)中國(guó)株不同于秘魯株和以色列株。
　　 4.人博卡病毒