超臨界流體萃取技術(shù)提取西青果有效成分及體外抗氧化活性初步研究.pdf

1、本文將超臨界CO2萃取技術(shù)，與丙酮提取和水提取技術(shù)集成使用，即采用固定床連續(xù)性提取法，依次使用超臨界CO2、丙酮和水對西青果有效成分進行提取;采用Folin-Ciocalteu法測定西青果提取物總酚含量，并建立高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)對提取物中主要酚酸類化合物進行質(zhì)量控制;采用3種抗氧化活性方法對不同溶劑提取物進行了體外抗氧化活性初步研究。為西青果的應(yīng)用開發(fā)

2、提供研究基礎(chǔ)。
　　方法及結(jié)果:
　　第一部分 超臨界流體萃取技術(shù)提取西青果有效成分工藝研究
　　方法:
　　1.西青果物理特性考察
　　考察西青果藥材粗粉的粒徑分布、水分含量、真密度、表觀密度和孔隙度五個物理特性
　　2.固定床連續(xù)性提取工藝
　　在40℃、300bar的條件下，依次使用超臨界CO2(scCO2)、丙酮和水作為溶劑，對西青果藥材進行提取。提取時間共18h，每20min收集一次提

3、取液。提取液經(jīng)濃縮、干燥后分別得超臨界CO2提取物、丙酮提取物、水提取物。
　　3.固定床一步法提取工藝
　　在40℃、300bar的條件下，僅使用丙酮/水作為溶劑對西青果藥材進行提取。萃取時間共12h。每30min收集一次提取液，提取液經(jīng)濃縮干燥后分別得到丙酮提取物和水提取物。
　　4.常壓提取工藝
　　在40℃、常壓條件下，采用回流提取法對西青果藥材進行提取。提取液經(jīng)濃縮干燥后分別得到丙酮提取物和水提取物。<

4、br>　　結(jié)果:
　　1.西青果藥材物理特性考察結(jié)果
　　粒徑分布:西青果粒徑分布范圍為34.913％(0～0.1mm)，20.498％(0.1～0.2mm)，16.09％(0.2～0.3mm),11.925％(0.3～0.4mm),5.299％(0.4～0.5mm),7.193％(0.5～0.6mm),1.939％(0.6～0.7mm),1.15％(0.7～0.8mm),0.993％(0.8～1mm)。
　　水分含量

5、:10.86±0.01％.
　　2.固定床連續(xù)性提取工藝結(jié)果
　　固定床連續(xù)性提取工藝各溶劑提取率:超臨界CO2提取率為1.25±0.04％;丙酮提取率為28.15±0.94％;水提取率為33.44±0.56％;總提取率為62.84±1.54％。
　　3.固定床一步法提取工藝結(jié)果
　　固定床一步法提取工藝各溶劑提取率:丙酮提取率為41.28±0.84％;水提取率為55.60±1.41％。
　　4.常壓提取工

6、藝結(jié)果
　　常壓提取工藝各溶劑提取率:丙酮提取率為37.46±1.56％;水提取率為45.52±1.52％。
　　第二部分 西青果提取物總酚及主要酚酸類化合物含量測定研究
　　方法
　　1.總酚含量測定
　　標準曲線的繪制:配制系列濃度的沒食子酸標準液，分別加入0.5mL福林酚試劑，暗處放置5min后各加入2mL20％Na2CO3溶液，定容至25mL?；靹蚝笫覝乇芄夥胖?h，分別測試溶液在760nm處的光密

7、度值。以質(zhì)量濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線。
　　2.線性關(guān)系考察
　　將標準品按規(guī)定色譜條件測定訶黎勒酸、沒食子酸、柯里拉京、訶子寧、訶子酸色譜峰峰面積。進行線性回歸處理得到?jīng)]食子酸、柯里拉京、訶子寧、訶黎勒酸、訶子酸的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。
　　3.精密度實驗
　　配置各對照品低濃度溶液、中濃度溶液、高濃度溶液，按規(guī)定色譜條件下每天平行進樣5份，考察其日內(nèi)精密度，并連續(xù)進樣3天用于考察其日間精密度

8、。
　　4.穩(wěn)定性實驗
　　將供試品分兩份，分別放置于-15℃與-4℃下，然后分別對放置第一天的供試品和放置第三天的供試品按規(guī)定色譜條件下進行實驗，分別測定訶黎勒酸，訶子酸，沒食子酸，訶寧子，柯里拉京的色譜峰面積并計算出面積比。
　　5.三種提取工藝樣品五種酚酸類成分的HPLC檢測
　　色譜柱為Ultimate LP-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇（流動相A）和0.6％磷酸（流動相B），進

9、行梯度洗脫，在流速1.2mL/min，檢測波長278nm，柱溫40℃條件下進行梯度洗脫。在該色譜條件下測定各供試品溶液五種酚酸類成分的含量。
　　結(jié)果:
　　1.總酚含量測定結(jié)果
　　沒食子酸標準曲線方程為Y=0.1089X+0.0056，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。沒食子酸在質(zhì)量濃度0-8μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
　　2.線性關(guān)系考察結(jié)果
　　沒食子酸、柯里拉京、訶子寧、訶黎勒酸、訶子酸分別在進樣

10、量為0.75-10μg/mL、0.75-10μg/mL、1.2563-20.10μg/mL、2.5125-40.2μg/mL、0.75-10μg/mL的范圍內(nèi)時線性關(guān)系良好。
　　3.精密度實驗結(jié)果
　　日內(nèi)精密度與日間精密度RSD均在5％以內(nèi)，說明方法以及儀器的精密度良好。
　　4.穩(wěn)定性實驗結(jié)果
　　據(jù)實驗結(jié)果可知標準品在-15℃的時候較之在-4℃時穩(wěn)定。
　　5.三種提取工藝樣品五種酚酸類成分HPLC

11、檢測結(jié)果
　　固定床連續(xù)性提取工藝各溶劑五種酚酸類成分收率:超臨界CO2提取的總酚酸收率幾乎忽略不計;丙酮提取的總酚酸收率為17.61±0.37％;水提取的總酚酸收率為10.64±0.43％。丙酮提取了大部分酚酸化合物(約62.34％)，遠高于水提取的酚酸化合物（約37.66％）。
　　固定床一步法提取工藝各溶劑總酚酸收率:丙酮的總酚酸收率為23.26±0.87％;水提取的總酚酸收率為16.08±0.29％。
　　常壓

12、提取工藝各溶劑總酚酸收率:丙酮提取的總酚酸收率為14.57±0.51％;水提取的總酚酸收率為12.19±0.14％。
　　第三部分 西青果提取物體外抗氧化活性初步研究
　　方法:
　　1.DPPH自由基清除活性測定
　　配制質(zhì)量濃度為100μg/mL的DPPH溶液。各提取物樣品分別配制成質(zhì)量濃度為5、10、25、50、125和250μg/mL的樣品溶液備用。
　　2.ABTS自由基清除活性測定
　　配

13、制在734nm處吸光度值為0.70±0.02的ABTS+·溶液。分別稱取固定床一步法丙酮提取物、水提取物、以及對照品Vc各40mg，用甲醇配制質(zhì)量濃度為4mg/mL的3種樣品母液。將三種樣品母液分別配制成質(zhì)量濃度為5、10、20、40、80、160、320和640μg/mL的樣品溶液備用。
　　3.還原性法測定抗氧化活性
　　分別稱取固定床一步法丙酮提取物、水提取物、以及對照品Vc各40mg，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為4mg/m

14、L的3種樣品母液。將3種樣品母液分別配制成質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32和0.64mg/mL的樣品溶液備用。以Vc為對照，甲醇做空白，平行操作實驗3次，采用紫外分光光度法測定溶液在700nm波長處的光密度值。測定的光密度值越高則代表化合物的還原能力越強。
　　結(jié)果:
　　1.DPPH自由基清除活性測定結(jié)果
　　固定床連續(xù)性提取法丙酮提取物和水提取物的EC50值分別為14

15、.94μg/mL和43.45μg/mL。
　　2.ABTS自由基清除活性測定結(jié)果
　　西青果丙酮提取物和水提取物的EC50值分別為20.273μg/mL和33.064μg/mL，Vc的EC50值為17.680μg/mL;由總酚含量和EC50值結(jié)果可以推算出丙酮和水兩種提取方法藥材清除ABTS自由基的EC50值分別為32.583μg/mL和72.282μg/mL，提示以丙酮作為溶劑時西青果藥材清除ABTS自由基效果是以水作為溶

16、劑的2.22倍。
　　3.還原能力測定結(jié)果
　　西青果丙酮及水提取物的還原能力均表現(xiàn)出與質(zhì)量濃度的相關(guān)性，濃度越高，還原能力越強。表明西青果兩種提取物均有一定的還原力，且丙酮提取物的還原力均大于同等質(zhì)量濃度下水提取物的還原力。當質(zhì)量濃度為0.005～0.04mg/mL時，兩種提取物光密度值隨質(zhì)量濃度的增加趨于平緩;當質(zhì)量濃度為0.04～0.32mg/mL時，兩種提取物光密度值快速增加;當質(zhì)量濃度為0.64mg/mL時，丙酮、

17、水提取物及Vc的光密度值分別為1.877、1.547和2.281。
　　結(jié)論:
　　1.固定床連續(xù)性提取工藝具有更高的效率和收率。西青果提取物總收率為62.84±1.54％，其中超臨界CO2提取率為1.25±0.04％，丙酮提取率為28.15±0.94％，水提取率為33.44±0.56％。較好的提高了西青果萃取的收率。
　　2.采用Folin-Ciocalteu法測定西青果提取物總酚含量，并建立HPLC法同時測定西青果