心肌細(xì)胞阻抗和電位傳感器在離子通道類海洋毒素檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代化工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，海洋生物毒素已經(jīng)嚴(yán)重威脅到全人類的生命健康，尤其是離子通道類海洋毒素。它們占了總毒素的80％以上，是海洋生物毒素中分布最廣危害最大的一類毒素，很可能會(huì)引發(fā)某些離子通道類疾病。傳統(tǒng)的小鼠生物法為標(biāo)準(zhǔn)的毒素檢測(cè)法，但因其種種局限（例如靈敏度低、重復(fù)性差等），已難以滿足海洋毒素日常監(jiān)測(cè)的需要。常規(guī)的基于化學(xué)結(jié)構(gòu)的高效液相色譜分析法(HPLC)，因其設(shè)備昂貴和技術(shù)復(fù)雜也難以完全取代小鼠生物法。近年來(lái)，一些基于功能活性

2、的細(xì)胞檢測(cè)法陸續(xù)發(fā)展起來(lái)，但傳統(tǒng)的細(xì)胞檢測(cè)手段較耗時(shí)且不能實(shí)時(shí)反映細(xì)胞的動(dòng)態(tài)信息。
　　細(xì)胞傳感器作為一種新型的功能性細(xì)胞檢測(cè)法，因其無(wú)損、高靈敏、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)而備受國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。目前，細(xì)胞傳感器在海洋毒素研究中的應(yīng)用還為數(shù)不多，它結(jié)合了細(xì)胞檢測(cè)和生物傳感器的各自優(yōu)點(diǎn)，是一項(xiàng)十分有前景的毒素檢測(cè)技術(shù)。本文選擇穩(wěn)態(tài)性和魯棒性強(qiáng)的電興奮心肌細(xì)胞作為敏感元件，旨在構(gòu)建高性能心肌細(xì)胞阻抗和電位傳感器，并將其應(yīng)用于離子通道類海洋

3、毒素的檢測(cè)分析。
　　本論文的主要?jiǎng)?chuàng)新性的工作在于:
　　1.設(shè)計(jì)了高通量和多通道細(xì)胞電位傳感器系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了心肌細(xì)胞胞外場(chǎng)電位的高通量和多通道檢測(cè)
　　本文設(shè)計(jì)了兩種細(xì)胞電位傳感器芯片:單孔32通道微電極陣列(MEA)芯片和高通量16孔64通道MEA芯片。同時(shí)針對(duì)這兩種MEA芯片開發(fā)了3種細(xì)胞電位傳感器系統(tǒng):單孔32通道細(xì)胞電位傳感器、單孔8通道無(wú)線細(xì)胞電位傳感器、高通量細(xì)胞電位傳感器。最后通過心肌細(xì)胞胞外場(chǎng)電位實(shí)驗(yàn)，

4、驗(yàn)證了三者均具備良好的胞外場(chǎng)電位檢測(cè)功能。兩種單孔多通道細(xì)胞電位傳感器實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)胞外場(chǎng)電位(EFP)的多位點(diǎn)檢測(cè)。相比于單孔32通道細(xì)胞電位傳感器，8通道無(wú)線細(xì)胞電位傳感器在外型上實(shí)現(xiàn)了便攜式小型化，更方便于EFP檢測(cè)。高通量細(xì)胞電位傳感器在單孔細(xì)胞電位傳感器的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了多個(gè)細(xì)胞樣本EFP的同步檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)效率。
　　2.深入研究了促進(jìn)心肌細(xì)胞與傳感器芯片耦合的改進(jìn)方法，并成功構(gòu)建了高度穩(wěn)定性和一致性的心肌細(xì)胞阻抗和

5、電位傳感器
　　本文深入研究了芯片表面蛋白修飾法和優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)密度法對(duì)心肌細(xì)胞和傳感器芯片耦合的促進(jìn)作用。研究結(jié)果表明，對(duì)于細(xì)胞阻抗傳感器(ECIS)芯片而言，心肌細(xì)胞按優(yōu)化密度12 k/well（8.5萬(wàn)/cm2）培養(yǎng)在經(jīng)高分子蛋白明膠修飾的96孔ECIS培養(yǎng)板上，可促使心肌細(xì)胞和ECIS芯片形成高度緊密的耦合。在此條件下構(gòu)建的高通量心肌細(xì)胞阻抗傳感器，能穩(wěn)定輸出一致性良好的搏動(dòng)信號(hào)（搏動(dòng)幅值:0.045-0.05;搏動(dòng)頻率:9

6、0-105次/min），信號(hào)穩(wěn)定期（毒素干預(yù)的最佳時(shí)期）可以維持32 h;對(duì)于MEA芯片而言，研究結(jié)果表明了心肌細(xì)胞按優(yōu)化密度12萬(wàn)/cm2培養(yǎng)在經(jīng)明膠修飾的單孔MEA芯片上，可促使心肌細(xì)胞和MEA芯片形成高度緊密的耦合。在此條件下構(gòu)建的單孔8通道無(wú)線心肌細(xì)胞電位傳感器，能穩(wěn)定輸出一致性良好的胞外場(chǎng)電位(EFP)信號(hào)（峰電位幅值:16-1.8 mv;發(fā)放頻率:150-180次/min），信號(hào)穩(wěn)定期可以維持60 h。本文同時(shí)選了兩種典型的

7、工具藥物異丙腎上腺素和利多卡因?qū)?yōu)化后的兩種高性能心肌細(xì)胞傳感器進(jìn)行了分析性能的測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了心肌細(xì)胞阻抗和電位傳感器均對(duì)測(cè)試藥物做出了正確而靈敏的響應(yīng)，具備良好的檢測(cè)分析功能。
　　3.提出了高通量檢測(cè)石房蛤毒素(STX)、河豚毒素(TTX)的心肌細(xì)胞阻抗傳感器檢測(cè)方法
　　本文將優(yōu)化后的高通量心肌細(xì)胞阻抗傳感器應(yīng)用于離子通道類海洋毒素的毒性評(píng)價(jià)，提出了一種新型高通量的離子通道類海洋毒素功能性檢測(cè)法。我們主要研究了3

8、種具有代表性的離子通道類海洋毒素(STX、TTX、PbTx-2)的毒性作用。通過分析毒素作用24 h后心肌細(xì)胞阻抗傳感器的信號(hào)特征參數(shù)（細(xì)胞指數(shù)CI、搏動(dòng)幅值BA、搏動(dòng)頻率BR）的變化，得出該阻抗傳感器對(duì)PbTx-2的敏感性較差，對(duì)高濃度（4μM，3.6 ppm）的PbTx-2沒有響應(yīng);對(duì)STX的敏感參數(shù)為BR，檢出限為0.09 ng/mL，檢測(cè)范圍為0.25～20 nM和0.18～14.6μM;對(duì)TTX的敏感參數(shù)為BR，檢出限為89

9、ng/mL，檢測(cè)范圍為0.4～20μM。該阻抗傳感器實(shí)現(xiàn)了STX高通量高靈敏檢測(cè)。心肌細(xì)胞電位傳感器法具有通量高、檢出限低、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，有望成為新型高通量的離子通道類海洋毒素檢測(cè)平臺(tái)。
　　4.提出了快速檢測(cè)石房蛤毒素(STX)、河豚毒素(TTX)和短裸甲藻毒素(PbTx-2)的心肌細(xì)胞電位傳感器檢測(cè)法
　　基于心肌細(xì)胞阻抗傳感器檢測(cè)法的研究基礎(chǔ)，本文將優(yōu)化后的單孔8通道無(wú)線心肌細(xì)胞電位傳感器應(yīng)用于離子通道類海洋毒素的毒

10、性評(píng)價(jià)，提出了一種新型快速的離子通道類海洋毒素功能性檢測(cè)法。我們同樣選擇STX、TTX、PbTx-2作為研究對(duì)象，通過分析毒素作用5 min后心肌細(xì)胞電位傳感器EFP信號(hào)特征參數(shù)（峰電位幅值SA、發(fā)放頻率FR、峰電位半時(shí)程SPD.50）的變化，得出該電位傳感器對(duì)STX和PbTx-2的敏感參數(shù)分別為FR和SPD50，檢出限分別為0.35 ng/mL和1.55 ng/mL檢測(cè)范圍均為1.56～400 nM;對(duì)TTX的敏感參數(shù)為FR，檢出限分