三葉斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白的鑒定及功能研究.pdf

1、三葉斑潛蠅Liriomyza trifolu，是一種多食性的世界性害蟲，危害多種蔬菜、花卉，造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降。氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein，OBP)是一類存在于昆蟲嗅覺感器淋巴液中的小分子酸性蛋白，特異性識(shí)別氣味分子，并將化學(xué)信號(hào)傳遞到受體，引發(fā)嗅覺反應(yīng)。本研究通過對(duì)三葉斑潛蠅進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定并克隆氣味結(jié)合蛋白基因，對(duì)其時(shí)空表達(dá)情況進(jìn)行分析，進(jìn)行原核表達(dá)及純化，研究其氣味結(jié)合特性及免疫定位情況，為三

2、葉斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白研究及其嗅覺機(jī)制提供理論依據(jù)，為綠色防治三葉斑潛蠅提供新的思路和方法。
　　通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，最終得到9個(gè)三葉斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白基因，命名為LtriOBP1-9，分為三個(gè)亞家族.7個(gè)Classic OBPs，1個(gè)Minus-C OBP和1個(gè)Dimer OBP，而9個(gè)三葉斑潛蠅OBPs的無根進(jìn)化樹顯示其之間的同源性較低，但與美洲斑潛蠅的氣味結(jié)合蛋白具有非常高的同源性。
　　采用qPCR技術(shù)

3、，對(duì)其進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)在不同發(fā)育階段，LtriOBP5在幼蟲期大量表達(dá)，LtriOBP4在蛹期大量表達(dá)，剩下的7個(gè)LtriOBPs均在成蟲期大量表達(dá)，且雄蟲表達(dá)量均高于雌蟲，雄蟲表達(dá)量隨日齡上升或者下降。在不同組織部位中，除了在觸角中特異性表達(dá)，還有的在頭部，足部具有一定的表達(dá)量。LtriOBPs時(shí)空表達(dá)的差異性，側(cè)面反映出其不僅參與嗅覺過程，還參與味覺反應(yīng)、生長發(fā)育等過程相關(guān)。
　　為了進(jìn)一步研究得到的三葉斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白

4、的蛋白功能，對(duì)7個(gè)三葉斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)及純化，獲得了具有高純度的目的蛋白。
　　使用1-NPN為熒光探針，測(cè)定LtriOBP1-7與25種氣味物質(zhì)的結(jié)合能力。LtriOBP1與13種氣味物質(zhì)有結(jié)合，其中與β-紫羅蘭酮，亞油酸有較強(qiáng)的結(jié)合能力，LtriOBP2與21種氣味物質(zhì)有結(jié)合，其中與β-紫羅蘭酮，1-辛烯-3-醇，苯并噻唑結(jié)合能力最強(qiáng);LtriOBP3與9種氣味物質(zhì)有結(jié)合，與β-紫羅蘭酮結(jié)合能力較強(qiáng)，LtriO

5、BP4只與3種氣味物質(zhì)苯并噻唑，芳樟醇，對(duì)乙基苯乙酮有結(jié)合，且結(jié)合能力均較弱;LtriOBP5只與3種氣味物質(zhì)·α-紫羅蘭酮，亞油酸，亞麻酸有結(jié)合，其中與亞麻酸結(jié)合能力最強(qiáng)，LtriOBP6與8種氣味物質(zhì)有結(jié)合，其中與芳樟醇，亞油酸有較強(qiáng)結(jié)合能力，LtriOBP7與21種氣味物質(zhì)均有較強(qiáng)的結(jié)合能力，其中與油酸，β-紫羅蘭酮，亞油酸有很強(qiáng)的結(jié)合能力。三葉斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白的結(jié)合特性為其引誘劑和驅(qū)避劑的開發(fā)利用提供參考。
　　利用冷凍

6、切片、免疫熒光染色技術(shù)對(duì)LtriOBP1-7在三葉斑潛蠅頭部、口器、前足附節(jié)及幼蟲和蛹中的蛋白分布情況進(jìn)行研究。在對(duì)觸角鞭節(jié)的蛋白定位中發(fā)現(xiàn)，毛形感器和腔錐感器存在著多種具有廣譜性結(jié)合氣味物質(zhì)能力的LtriOBPs，表明這兩種感器可能參與三葉斑潛蠅對(duì)寄主植物的識(shí)別、定位過程等多種嗅覺反應(yīng)。而錐形感器中存在的OBPs對(duì)氣味更具有選擇性，表明錐形感器可能參與特異性的氣味識(shí)別過程。此外，還發(fā)現(xiàn)LtriOBP2、5分布于觸角的梗節(jié)中，說明梗節(jié)也