結(jié)核分枝桿菌人新B細(xì)胞表位及10種特異蛋白的抗原性研究.pdf

1、在結(jié)核病（TB）的免疫學(xué)研究中，特異抗原及其抗原表位的研究對(duì)結(jié)核病的診斷技術(shù)和疫苗發(fā)展具有極為重要的作用?？乖砦皇菦Q定抗原特異性和免疫效能的特殊基團(tuán)或空間結(jié)構(gòu)。B細(xì)胞表位在感染免疫中發(fā)揮了重要作用，如激活體液免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，研究抗原 B細(xì)胞表位，有助于結(jié)核病快速診斷試劑和疫苗的研究。本研究一是開(kāi)展結(jié)核分枝桿菌(MTB)新抗原的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)和篩選，二是選取抗原表位數(shù)較多的特異性抗原進(jìn)行克隆表達(dá)純化，并對(duì)純化的重組蛋白

2、及 B表位多肽進(jìn)行血清學(xué)評(píng)價(jià)，為研發(fā)結(jié)核病特異診斷試劑和新疫苗提供基礎(chǔ)。
　　根據(jù)基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫組學(xué)和生物信息學(xué)原理，排除PE/PPE蛋白、轉(zhuǎn)座子基因以及已知B表位的蛋白抗原，從結(jié)核分枝桿菌全基因組的蛋白質(zhì)基因序列中篩選新的蛋白抗原。利用生物信息學(xué)和SEPPA2.0軟件，預(yù)測(cè)新抗原的B細(xì)胞表位，分析、優(yōu)選并合成B細(xì)胞表位多肽。
　　閱讀文獻(xiàn)、根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)和免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)（IEDB），分

3、析并選擇有抗原表位的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原。蛋白抗原的編碼基因以標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的DNA為模板，PCR擴(kuò)增并提取目的基因，以原核表達(dá)載體PET32a構(gòu)建重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定和測(cè)序100％正確的重組子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析鑒定。大量誘導(dǎo)后鎳離子親和層析柱層析純化，純化效果不理想的蛋白再次使用純化試劑盒進(jìn)行純化。純化后的包涵體進(jìn)行復(fù)性，使用BCA法對(duì)蛋白的濃度進(jìn)行測(cè)定。
　　將合成的B細(xì)胞表位多肽及純化后的蛋白包被酶標(biāo)板，

4、棋盤(pán)滴定法確定抗原及多肽、一抗和二抗的最佳稀釋度，以結(jié)核病人血清及健康志愿者的血清為一抗，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)B細(xì)胞表位多肽及重組蛋白抗原進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　本研究經(jīng)過(guò)軟件的預(yù)測(cè)及篩選，成功預(yù)測(cè)并合成了結(jié)核分枝桿菌3個(gè)新蛋白的共13條B細(xì)胞線性表位多肽，包括蛋白SodC成功合成3條， Mog為4條和Rv1566c為6條，每條多肽的純度大于90%，滿足實(shí)驗(yàn)要求。Mog抗原成功預(yù)測(cè)了構(gòu)象表位，構(gòu)象表位需要通過(guò)重組蛋白的克隆

5、表達(dá)，再進(jìn)行血清學(xué)驗(yàn)證。
　　本研究通過(guò)文獻(xiàn)檢索及生物信息學(xué)篩選，確定了9個(gè)已知特異性蛋白抗原，并完成了此九種蛋白及構(gòu)象表位抗原Mog的克隆表達(dá)純化，酶切鑒定結(jié)果正確，測(cè)序結(jié)果與NCBI中的序列完全一致。10種蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)純化，最終得到了純化效果較理想的重組蛋白。
　　間接ELISA法對(duì)B表位多肽及10種蛋白抗原進(jìn)行評(píng)價(jià)，棋盤(pán)滴定確定多肽的包被濃度為3.13μg/ml，蛋白抗原PfkB、Rv2628、Rv2653c、Mpt

6、83、Mpt70、Lppx、EsxR、FadD28、DevS和Mog的最佳包被濃度分別為0.46μg/ml、1.03μg/ml、1.31μg/ml、1.53μg/ml、1.20μg/ml、1.15μg/ml、5.53μg/ml、0.85μg/ml、1.08μg/ml和1.65μg/ml。血清的最佳稀釋度PfkB為1:50，EsxR為1:400，Rv2628、Rv2653c、Mpt83、Mpt70、Lppx、FadD28、DevS、Mog

7、及多肽的血清最佳稀釋度均為1:100。
　　該實(shí)驗(yàn)選取了104份陽(yáng)性血清和104份陰性血清，ELISA法分別對(duì)10種蛋白抗原及13條多肽進(jìn)行血清學(xué)評(píng)價(jià)。使用SPSS17.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，PfkB、Rv2628、Rv2653c、Mpt83、Mpt70、Lppx、EsxR、FadD28、DevS和Mog的靈敏度分別為73.08%、54.81%、58.65%、94.23%、79.81%、77.88%、92.31%、86.54%、91

8、.35%、89.42%，特異度分別為90.57%、94.34%、87.74%、59.43%、86.79%、77.36%、62.26%、82.08%、83.96%、69.81%，ROC曲線下面積分別為0.882、0.789、0.773、0.825、0.884、0.851、0.822、0.891、0.870和0.901。除Rv2628、Rv2653c的Youden指數(shù)小于0.5外，其它蛋白的Youden指數(shù)均大于0.5，Mog的Youden

9、指數(shù)最大為0.734。SodC的3條B細(xì)胞表位多肽，靈敏度分別為88.46%、65.38%、72.12%，特異度為75.96%、91.35%和89.42%，ROC曲線下面積均大于0.85。Mog蛋白的4條B細(xì)胞表位多肽中P209的靈敏度、特異度最高，分別為88.46%、88.69%，ROC曲線下面積為0.934。Rv1566c的6條B細(xì)胞表位多肽，靈敏度范圍為77.88%~92.31%，特異度介于69.23%~85.58%，ROC曲線下