水稻端粒及著絲粒相關序列的轉化及其功能研究.pdf

1、具有自主復制功能的真核生物染色體必須具備三大基本組成要素，即著絲粒(Centromere)、復制原點(Origin of replication)和端粒(Tolomere)，這三個組成要素已在一些模式生物的人工染色體構建中得到驗證。著絲粒既是姊妹染色單體的結合點，又是紡錘絲的附著點，因而在染色體配對及維系生物體遺傳信息穩(wěn)定傳遞中起重要作用。而端粒的序列最為簡單，不同生物類型間的保守性也最強，不同物種之間均為TT(T)AGGG不同數(shù)量的簡

2、單串聯(lián)重復序列。在功能上，端粒對于維持染色體的完整性顯得尤為重要，對于缺少端粒的染色體，它將不斷發(fā)生斷裂，因而在細胞分裂過程中不能穩(wěn)定傳遞。 水稻是重要的糧食作物，同時也是單子葉植物基因組及分子生物學研究的重要模式生物。用水稻來研究端粒及著絲粒的結構與功能具有以下幾方面的優(yōu)點：1)水稻全基因組已經(jīng)測序，從而可以為端粒及著絲粒研究提供豐富的基因組信息；2)水稻染色體很小，含有的重復序列也較少，更利于與分子生物學技術相結合，采用具有

3、很高分辨率的粗線期染色體進行熒光原位雜交，這是具大染色體生物所無法進行的；3)水稻的遺傳轉化比較容易，因此利用轉基因技術將一段端粒及著絲粒相關序列插入到水稻受體細胞中，一方面可研究該插入序列的功能，同時還可以獲得相應的細胞學變異材料，為深入研究它們的功能提供豐富的基礎材料。 本研究構建了水稻端粒和著絲粒相關DNA序列的表達載體，應用農桿菌介導法將其轉化到水稻品種中，獲得了一批轉化水稻植株，主要研究結果如下： 1、秈稻的遺

4、傳轉化比粳稻難度大，為探索一套適合秈稻農桿菌轉化的技術體系，以秈稻品種中秈3037為材料，研究了影響農桿菌介導轉化效率的幾個重要因素，結果表明：MS Ⅱ培養(yǎng)基作為愈傷組織的誘導培養(yǎng)基要好于N6D2培養(yǎng)基；以幼胚為外植體，愈傷組織的誘導率和轉化率明顯比成熟胚和幼穗高；根癌農桿菌菌株EHA105介導的基因轉化率要高于AGLO；當以幼胚為外植體時，根癌農桿菌菌株EHA105介導的中秈3037轉化率為18.0％，而AGLO0僅為5.5％；EHA

5、105菌液OD值為0.6，浸染時間14min為中秈3037合適的轉化參數(shù)；在分化培養(yǎng)基MSR中添加20g/L的山梨醇有利于抗性愈傷組織的分化。在此基礎上，采用優(yōu)化的農桿菌介導法轉化中秈3037及其來源的突變體A和B，獲得了轉化植株，PCR、Southern雜交和T1代遺傳分析均表明外源基因已經(jīng)整合到水稻基因組中。 2、采用優(yōu)化的農桿菌介導方法，將GFP-OsCENH3嵌合基因導入水稻品種中秈3037中，經(jīng)PCR及Southern

6、雜交檢測，證明該嵌合基因確已整合到水稻的基因組中。對T0及T1代轉基因水稻植株有絲分裂和減數(shù)分裂過程中GFP蛋白與水稻CENH3蛋白表達關系的研究表明，CENH3的表達部位與GFP蛋白的表達部位完全重疊，說明GFP蛋白與水稻CENH3蛋白已構成融合蛋白，并且定位于染色體的著絲粒部位。為探索該轉基因植株在水稻遺傳及分子生物學研究中的作用，利用花粉母細胞減數(shù)分裂偶線期染色體，借助水稻著絲粒串聯(lián)重復序列ContO的FISH，發(fā)現(xiàn)GFP信號與C

7、ontO信號完全重疊，證明ContO序列確實為水稻不同染色體功能性著絲粒的主要成分。利用該轉基因植株，分別制作根尖細胞有絲分裂染色體和花粉母細胞減數(shù)分裂染色體制片，與anti-α-tublin微管蛋白抗體和anti-PAIR2抗體進行熒光免疫染色反應，表明該轉基因植株攜帶GFP標記的著絲粒，可以與其它分子生物學手段相結合，并能在活體細胞及組織中十分方便地顯示每一染色體功能性著絲粒位置，為深入研究著絲粒功能提供了寶貴的遺傳材料。

8、3、根據(jù)水稻端粒酶基因的生物信息學分析，利用RNA干涉技術使水稻中端粒酶亞基失活，并借此來影響水稻染色體的端粒長度。用農桿菌介導法將表達載體pCam23A-1-2導入水稻品種日本晴中，獲得了78個轉化子，得到了165棵轉化植株。通過PCR檢測和Southern雜交分析，初步證明獲得了端粒酶亞基失活的轉基因水稻；應用染色體末端限制片段分析法結合FISH檢測分析，顯示在端粒酶亞基失活的水稻中端粒DNA序列長度有逐代縮短的趨勢，但是在轉基因水

9、稻的T0和T1代植株中其主要農藝性狀沒有發(fā)生明顯變化。 4、應用農桿菌介導法將602bp的端粒DNA序列導入粳稻品種武香粳9號中，獲得了652個轉化子，得到了1782棵單株，根據(jù)表型觀察、T-DNA的PCR檢測和Southern雜交結果，初步證明端粒DNA序列已經(jīng)整合到轉基因水稻中，在轉基因植株的后代中獲得了一系列突變體，其中涉及染色體變異的包括同源四倍體、非整倍體，染色體相互易位突變體等。而涉及單個基因變異的包括早熟、遲熟、矮

10、稈、低育等突變體。 5、利用農稈菌介導法轉化粳稻品種武香粳9號，產生T-DNA插入群體。在篩選和鑒定水稻T-DNA插入突變體的過程中，發(fā)現(xiàn)一個矮稈突變體。利用PCR擴增、Southern雜交等分子生物學方法對該突變體后代進行了鑒定及遺傳分析。遺傳分析表明，突變體自交后代群體中出現(xiàn)矮稈和正常株高兩種類型，分離比為3：1，符合一對顯性單基因控制的遺傳模式，并且矮稈性狀的表現(xiàn)與T-DNA插入共分離。利用秈稻品種龍?zhí)馗εc其純合矮稈植株進