促生長激素神經(jīng)肽在感覺和交感神經(jīng)節(jié)的表達及有關的痛覺調(diào)節(jié)機制.pdf

1、促生長激素神經(jīng)肽(galanin，Gal)是一個由29/30個氨基酸(在大多數(shù)物種為29個氨基酸，在人為30個氨基酸)組成的神經(jīng)肽，在神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛的表達，可發(fā)揮調(diào)節(jié)傷害性刺激、神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)營養(yǎng)等多種生物學功能。在周圍感覺神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和交感神經(jīng)節(jié)(sympathetic ganglion，SG)神經(jīng)元都檢測到Gal的表達。Gal在周圍神經(jīng)系統(tǒng)對損傷的適應性反應及調(diào)節(jié)痛覺傳遞的過程中可能發(fā)揮作用。Gal被認為是背根神經(jīng)節(jié)(dorsal

2、 root ganglion，DRG)神經(jīng)元損傷的標志物之一和交感神經(jīng)元軸突受到嚴重損傷時神經(jīng)元表型改變的一個標志。在正常成年動物，Gal在感覺神經(jīng)元和SG神經(jīng)元表達的水平很低；在周圍神經(jīng)損傷和炎癥狀態(tài)下，Gal的表達顯著上調(diào)。 外周去甲腎上腺素能系統(tǒng)與痛覺的調(diào)節(jié)有一定的關系。正常健康狀態(tài)下，去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)對痛覺的影響作用極小，在神經(jīng)損傷或炎癥時，去甲腎上腺素能系統(tǒng)發(fā)生的各種可塑性變化可影響其

3、對抗傷害性刺激的效能。不同的α-受體的亞型在交感神經(jīng)元有表達，這些受體激活后可影響交感神經(jīng)系統(tǒng)的活性或神經(jīng)遞質(zhì)的表達或釋放，并最終導致不同的效應。 感覺神經(jīng)肽和VR1的表達反映了DRG神經(jīng)元感受傷害性刺激的特性。在初級傳入神經(jīng)元表達的感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)(substance P,SP)在介導傷害性刺激的過程中發(fā)揮作用，Gal和SP可在同一個DRG感覺神經(jīng)元中共存。外源性的Gal是否能影響DRG神經(jīng)元VR1以及SP的表達尚需要進一步證

4、實。 本研究建立了DRG神經(jīng)元和頸上神經(jīng)節(jié)(superior cervical ganglion，SCG)神經(jīng)元培養(yǎng)模型，用這兩個培養(yǎng)模型，分別研究了NE、CAP、NGF對DRG神經(jīng)元Gal的表達的影響作用，NGF、6-OHDA、α-受體激動劑對SCG神經(jīng)元Gal表達的影響作用。用動物實驗探討了Gal在福爾馬林誘發(fā)的傷害性刺激中的作用及其機制。此外，NGF所致的DRG和SCG神經(jīng)元軸突再生與Gal表達的關系，CAP對DRG神經(jīng)元

5、GalR2表達的影響，外源性Gal對DRG神經(jīng)元SP釋放、VR1表達的影響作用在本實驗中也進行了探討。 DRG取自胚胎15 d的Wistar大鼠，SCG神經(jīng)元取自新生Wistar大鼠。DRG神經(jīng)元和SCG神經(jīng)元培養(yǎng)24 h后，再用阿糖胞苷(cytarabine，ara-C)作用24h抑制非神經(jīng)元細胞生長。之后，用不同的處理因素作用4 d或正常培養(yǎng)4 d后用不同的處理因素作用4 h后進行檢測。 (1)NE及α-受體拮抗劑孵育DRG

6、神經(jīng)元：DRG神經(jīng)元用NE(10-4 mol/L)孵育4 d，或在加入NE之前10 min，在培養(yǎng)液內(nèi)預先加入α1-受體拮抗劑哌唑嗪(10-6mol/L)或α2-受體拮抗劑育亨賓(10-5mol/L)。檢測對Gal及其mRNA的表達。 (2)NGF孵育DRG神經(jīng)元：DRG神經(jīng)元用NGF(10 ng/ml)或NGF(10ng/ml)加NE(10-4 mol/L)孵育4 d，檢測Gal及其mRNA的表達及單個神經(jīng)元的軸突總長度。

7、 (3)CAP孵育DRG神經(jīng)元：①DRG神經(jīng)元用不同濃度的CAP(10-8mol/L，10-7 mol/L,10 -6 mol/L)孵育4 h，檢測Gal和GalR2及其mRNA的表達；②DRG神經(jīng)元用不同濃度的CAP(10-8mol/L，10-7mol/L，10-6 mol/L)孵育4 d，檢測Gal和GalR2及其mRNA的表達。 (4)外源性Gal孵育DRG神經(jīng)元：DRG神經(jīng)元用不同濃度的Gal(10-9mol/L，1

8、0-8mol/L, 10-7mol/L)孵育4 d，檢測VR1及其mRNA、SPmRNA的表達及SP的釋放。在加入Gal之前10 min，預先加入GalR拮抗劑M35(10-8 mol/L)或PKC抑制劑CalphostinC(10-7mol/L)，檢測GalR拮抗劑及PKC抑制劑對Gal作用的影響。 (5)選擇性α-受體激動劑孵育SCG神經(jīng)元：SCG神經(jīng)元分別用α-受體激動劑苯腎上腺素(10-5mol/L)和α2-受體激動劑可

9、樂定(10-5mol/L)孵育4 d，檢測Gal及其mRNA的表達。 (6)NGF或/和6-OHDA孵育SCG神經(jīng)元：SCG神經(jīng)元用NGF(10 ng/ml)、6-OHDA(10-5mol/L)、NGF(10 ng/ml)加6-OHDA(10-5mol/L)孵育4 d，檢測Gal及其mRNA的表達及單個神經(jīng)元的軸突總長度。 動物實驗所用動物為體重為220-250g的雄性Wistar大鼠。隨機分為5組，每組10只動物。Ga

10、l組、福爾馬林組、福爾馬林+Gal組、福爾馬林+Gal+GalR拮抗劑組、福爾馬林+Gal+PKC抑制劑組。在大鼠左側后足底注射20μl2％的福爾馬林誘發(fā)炎癥，同時注射20μlGal(0.1 ng/μl)，之后進行縮足反射行為學檢測實驗。GalR拮抗劑(M35)在注射Gal前20 min、PKC抑制劑(CalphostinC)在注射Gal前60 min注射。Gal組、福爾馬林組分別只注射20 μl Gal(0.1ng/μl)或20 μl

11、 2％的福爾馬林。行為學檢測后，取左側腰骶部DRG和腰骶部SG，檢測Gal及其mRNA的表達。 本研究的結果顯示：(1)用NE(10-4 mol/L)孵育4 d后，培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中Gal及其mRNA的表達增加；用α1-受體阻斷劑哌唑嗪(10-6 mol/L)預處理可阻斷NE的這一效應；用α2-受體阻斷劑育亨賓(10-5mol/L)預處理則不影響NE引起的Gal及其mRNA的表達增加。(2)用NGF(10 ng/ml)孵育4

12、d后，培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中Gal及其mRNA的表達降低；NGF還可抑制NE誘發(fā)的Gal及其mRNA表達。NGF能促進DRG神經(jīng)元軸突再生，而NE則不能促進DRG神經(jīng)元軸突再生。(3)CAP(10-6mol/L)急性處理(4 h)或CAP(10-8mol/L，10-7mol/L)長期孵育(4 d)均可促進Gal及其mRNA的表達，CAP(10-7mol/L)長期孵育(4 d)可促進GalR2及其mRNA的表達。(4)外源性Gal可增加DR

13、G神經(jīng)元CAP誘發(fā)的SP釋放量，但不影響SP及其mRNA的表達以及基礎SP釋放量。外源性Gal可促進DRG神經(jīng)元VR1及其mRNA的表達，并呈劑量依賴方式。外源性Gal所致的DRG神經(jīng)元VR1表達增加可部分地被GalR拮抗劑M35或PKC抑制劑Calphostin C所抑制。(5)α2-受體激動劑可樂定(10-5mol/L)可抑制SCG神經(jīng)元Gal及其mRNA的表達，α1-受體激動劑苯腎上腺素(10-5mol/L)對SCG神經(jīng)元Gal及

14、其mRNA的表達無影響。(6)NGF(10 ng/ml)可抑制SCG神經(jīng)元Gal及其mRNA的表達；6-OHDA(10-5mol/L)孵育SCG神經(jīng)元，可促進Gal及其mRNA的表達；聯(lián)合應用NGF和6-OHDA，NGF不能抑制6-OHDA引起的Gal及其mRNA表達的上調(diào)，但NGF能促進SCG神經(jīng)元軸突再生。(7)注射福爾馬林可誘發(fā)大鼠自發(fā)性疼痛行為縮足反射，注射20 μl Gal(0.1 ng/μl)可增加縮足反射的次數(shù)。在注射Ga

15、l前注射30μl(20 ng/μl)Gal受體拮抗劑M35或30μl PKC抑制劑Calphostin C(0.1ng/μl)，可部分抑制Gal引起的疼痛增強效應。(8)大鼠足底內(nèi)注射福爾馬林可引起同側腰骶部DRG內(nèi)Gal mRNA表達增加，神經(jīng)肽Gal的表達無變化。腰骶部SG內(nèi)Gal及其mRNA表達均無變化。這些結果表明：(1)DRG神經(jīng)元內(nèi)Gal的表達可受NE、NGF、CAP等多種因素的影響。NE通過作用于α1-受體，而不是α2-受

16、體，增強了DRG神經(jīng)元Gal的表達，這可能是外周促進傷害性刺激的腎上腺素能調(diào)節(jié)機制之一。NGF抑制DRG神經(jīng)元內(nèi)Gal的表達，一定孵育時間和孵育濃度的CAP刺激DRG神經(jīng)元，Gal及其受體GalR2表達上調(diào)。這反映了Gal所介導的傷害性刺激作用機制的復雜性。 (2)SCG神經(jīng)元內(nèi)Gal的表達可受α2-受體激動劑、NGF、6-OHDA等多種因素的影響。交感神經(jīng)元α2-受體的激活對Gal的表達有抑制作用，表明α2-受體可能參與了Ga