苦馬豆素單鏈抗體基因的初步研究.pdf_第1頁(yè)
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1、瘋草(10coweed)的主要有毒成分吲哚茲定生物堿-苦馬豆素(swainsonine,SW),不僅能導(dǎo)致家畜中毒死亡,而且能夠引起母畜流產(chǎn)、不孕、胎兒畸形和公畜不育,給我國(guó)草原畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。從營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度看,瘋草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,是一種潛在的牧草資源,其抗逆性強(qiáng),在惡劣環(huán)境中能旺盛生長(zhǎng),應(yīng)當(dāng)把它看作生態(tài)群落的重要組成部分。如何有效防治瘋草對(duì)動(dòng)物的毒性,又可將它作為優(yōu)質(zhì)牧草加以利用,一直是人們研究的熱點(diǎn)。此外,目前SW的檢測(cè)方

2、法有薄層層析(TLC)定性分析、氣相色譜(GC)和高效液相色譜(HPLC)定量分析。SW與大多數(shù)生物堿包括吲哚茲定生物堿和喹諾茲定生物堿不同,對(duì)一般檢查生物堿試劑顯色不靈敏,只有在較高含量時(shí)才能用TLC檢測(cè)到。由于分子結(jié)構(gòu)中缺乏適合分光光度法檢測(cè)的發(fā)色基團(tuán),GC和HPLC不太適合SW的檢測(cè)。因此,尋找一種新的靈敏、便利的檢測(cè)SW方法也是當(dāng)務(wù)之急。本研究旨在構(gòu)建SW單鏈抗體基因,并期望將來能制備出SW特異性單鏈抗體,用于SW的免疫檢測(cè)和動(dòng)

3、物瘋草中毒的免疫防治。取得了如下研究結(jié)果: 1甘肅棘豆草中苦馬豆素的提取分離工藝比較研究本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,采用生物堿提取常用的醇類溶劑熱回流法、酸水冷浸法和水提取法3種工藝提取甘肅棘豆草中生物堿,在相同條件下均能分離得到白色針狀結(jié)晶,經(jīng)TLC,mp,IR,MS,<'1>HNMR鑒定為SW,平均得率分別為18.61μg/g、12.22μg/g、6.23μg/g。試驗(yàn)結(jié)果表明,工業(yè)酒精熱回流提取的效果最好,總堿得率最高,在相

4、同條件下升華得到的SW也比其它2種提取工藝多,是目前提取SW的一種最為經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的工藝。本研究探索出了甘肅棘豆草中SW提取的最優(yōu)化工藝,成功提取SW 500 mg,為后續(xù)的試驗(yàn)研究提供了原料上的保障。 2苦馬豆素-HSA對(duì)小鼠的免疫原性研究 12只Balb/c小鼠隨機(jī)分為A、B、C組,每組4只,A組為小劑量免疫組,B組為大劑量免疫組,C組為對(duì)照組。A組編號(hào)為A<,1>~A<,4>,B組編號(hào)為B<,1>~B<,4>。首次免疫時(shí),福氏

5、完全佐劑乳化SW-HSA,A、B組每只小鼠頸部?jī)蓚?cè)、背部皮下及后腿內(nèi)側(cè)5點(diǎn)注射,每點(diǎn)0.04mL,A組劑量為0.05 mg/只,B組劑量為0.10 mg/只。第30 d,第2次免疫,福氏不完全佐劑乳化SW-HSA,免疫途徑、劑量同首次免疫。第50 d,福氏不完全佐劑乳化SW-HSA,相同免疫途徑進(jìn)行第3次免疫,A組劑量為0.075 mg/只,B組劑量為0.15 mg/只。第70 d,生理鹽水溶解SW-HSA,背部皮下4點(diǎn),每點(diǎn)0.04.

6、mL和腹腔注射0.04 mL進(jìn)行第4次免疫,A組劑量為0.1125 mg/只,B組劑量為0.225 mg/只。第3次免疫后第10 d和第4次免疫后第10 d間接血凝試驗(yàn)(IHA)與間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)SW抗體效價(jià)。結(jié)果表明,SW-HSA可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生SW的特異性抗體。第3次免疫后第10 d,IHA測(cè)定A<,1>~A<,4>和B<,1>~B<,4>抗體滴度分別為2<'2>,2<'1>,2<'2>,2<'2>和2<'3>,

7、2<'2>,2<'2>,2<'2>。間接ELISA測(cè)定抗體滴度分別為2<'6>,2<'5>,2<'5>,2<'6>和2<'7>,2<'6>,2<'6>,2<'6>。第4次免疫后第10 d,IHA測(cè)定A<,1>~A<,4>和B<,1>~B<,4>抗體滴度分別為2<'7>,2<'6>,2<'6>,2<'6>和2<'6>,2<'5>,2<'5>,2<'5>。間接ELISA測(cè)定A<,1>~A<,4>和B<,1>~B<,4>抗體滴度分別為2<'1

8、0>,2<'9>,2<'10>,2<'9>和2<'9>,2<'8>,2<'8>,2<'8>。經(jīng)第4次免疫以后,獲得了高抗體滴度的免疫小鼠,為構(gòu)建SW單鏈抗體基因奠定了基礎(chǔ)。 3苦馬豆素單鏈抗體基因的構(gòu)建首先從3只抗體滴度較高的小鼠脾臟中提取出總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。參考Orlandi等設(shè)計(jì)的引物,V<,H>上游引物與抗體可變區(qū)FR1,Vк下游引物與抗體可變區(qū)FR4互補(bǔ),V<,H>下游引物3’端和Vк上游引物5’端和Linker兩端

9、互補(bǔ)。設(shè)計(jì)引物時(shí)引進(jìn)了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),既有利于與載體連接,也便于以后可變區(qū)基因在原核、真核中的克隆。通過PCR條件的探索,先用通用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出V<,H>、V<,L>基因,用15肽Linker引物對(duì)V<,L>基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增修飾得到V<,L>-Linker,重疊延伸(SOE)反應(yīng)與V<,H>基因拼接組裝成SeFv基因片段。這種先修飾再拼接、擴(kuò)增的策略,可提高SOE反應(yīng)的工作效率,避免了非特異性的發(fā)生。本研究通過RT-PCR、SOE-

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