LW-AFC對阿爾茨海默病模型小鼠學習記憶功能的作用及作用機理研究.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer`s disease，AD）屬神經(jīng)退行性疾病，是當前嚴重危害人類健康的重大疾病。AD患者腦內(nèi)典型的病理變化主要包括腦細胞外的β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）斑塊即老年斑（senile plague）、細胞內(nèi)沉積的磷酸化tau蛋白引起的神經(jīng)原纖維纏結和神經(jīng)元丟失。AD的臨床癥狀主要為進行性的記憶損害以及其他認知功能的下降，AD患者確診后的平均存活時間為9年，期間必須有專人進行看護，

2、因此AD對于社會、家庭都是巨大的負擔。目前用于AD治療的藥物主要分為乙酰膽堿酯酶抑制劑和 N-甲基-D-天冬氨酸（ N-Methyl-D-Aspartate，NMDA）受體拮抗劑兩大類，分別靶向膽堿能和谷氨酸能突觸傳遞。其中乙酰膽堿酯酶抑制劑主要針對治療輕中度AD，而NMDA受體拮抗劑主要治療中重度AD。但是臨床數(shù)據(jù)顯示，這些藥物對于AD的治療效果并不理想，僅能夠改善部分癥狀。此外，抗精神病藥、抗抑郁藥、抗驚厥藥、免疫療法、β-分泌酶/

3、γ-分泌酶抑制劑、α-分泌酶激動劑、tau蛋白聚集/磷酸化抑制劑、金屬離子螯合劑和維生素也用于改善 AD患者的認知功能和生活質(zhì)量，但治療效果依舊不理想。因此，目前為止，仍然沒有能夠有效預防或治療AD的方法。
　　上世紀90年代，我室與天然藥物化學研究室及沈陽藥科大學天然藥物化學教研室密切合作，對中醫(yī)滋補腎陰的經(jīng)典代表名方六味地黃湯的藥理作用、作用機理及藥效物質(zhì)基礎進行了系統(tǒng)研究。研究表明，六味地黃湯對快速老化模型小鼠SAMP8等多

4、種模型動物的學習記憶能力低下具有明顯改善作用。LW-AFC是從六味地黃湯中分離獲得的由活性成分群構成的中藥新藥，主要含苷類（LWD-b）、多糖（LWB-B）和寡糖（CA-30）三個主要藥效組分，具有藥效穩(wěn)定、質(zhì)量可控、制劑先進、服用方便等優(yōu)點。該藥已獲臨床批件，申報的第一個適應癥為更年期綜合征，目前正在進行II期臨床試驗。
　　本研究以快速老化小鼠 SAMP8和家族型 AD（familial Alzheimer`s disease

5、， FAD）模型小鼠 PrP-hAβPPswe/PS1ΔE9（APP/PS1）轉(zhuǎn)基因小鼠作為模型，研究了LW-AFC對中樞學習記憶能力、病理改變以及生物標志物的作用。以高月齡自然衰老小鼠 SAMR1為衰老模型，觀察 LW-AFC的抗衰老作用。通過檢測 HPA軸和HPG軸中的激素水平、脾淋巴細胞的增殖能力、脾淋巴細胞的亞群分型以及血漿中細胞因子的水平，揭示LW-AFC防治AD的作用機制及靶點。
　　第一部分 LW-AFC改善中樞學習

6、記憶功能的作用研究
　　1. LW-AFC對SAMP8小鼠中樞學習記憶功能的作用研究
　　選取6月齡雄性SAMP8小鼠，分別灌胃給予多奈哌齊（donepezil）（1mg/kg）、美金剛（memantine）（10mg/kg）、LW-AFC（0.8g/kg、1.6g/kg、3.2g/kg），以SAMR1小鼠作為對照。3個月后進行老化程度評分和自主活動實驗，觀察 LW-AFC對SAMP8小鼠衰老程度的影響；運用跳臺實驗、穿梭箱

7、實驗、Morris水迷宮實驗以及新異物體識別實驗，觀察LW-AFC對SAMP8小鼠中樞學習記憶功能的作用。結果顯示，給予1.6g/kg的LW-AFC能夠明顯降低SAMP8小鼠的老化評分；美金剛和LW-AFC（0.8g/kg、1.6g/kg、3.2g/kg）能夠顯著提高SAMP8小鼠的自主活動度；1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著提高 SAMP8小鼠的被動回避反應能力；美金剛、0.8g/kg和1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著提高SA

8、MP8小鼠空間學習記憶能力和主動回避反應能力；1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著提高SAMP8小鼠的短、長期物體識別記憶能力。該結果表明，LW-AFC能夠有效降低SAMP8小鼠的衰老程度，改善其學習記憶能力，且效果要優(yōu)于陽性藥多奈哌齊和美金剛。
　　2. LW-AFC對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中樞學習記憶功能的作用研究
　　選取 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠作為 FAD的模型小鼠，分別灌胃給予多奈哌齊（1mg/kg）、美金剛（

9、10mg/kg）、LW-AFC（1.6g/kg），C57小鼠作為對照。3個月后進行跳臺實驗、穿梭箱實驗、Morris水迷宮實驗以及新異物體識別實驗，觀察LW-AFC對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學習記憶功能的作用；采用免疫熒光染色和尼氏染色，觀察LW-AFC對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Aβ的沉積與神經(jīng)元丟失的作用；采用 AlphaELSA技術檢測血液和腦組織中的可溶性 Aβ含量，觀察 LW-AFC對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中Aβ水平的影響

10、。結果顯示，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學習記憶能力明顯低于野生型小鼠，給予 LW-AFC、美金剛和多奈哌齊能夠顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的主動回避反應能力；LW-AFC和美金剛能夠顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的空間記憶能力；LW-AFC能夠顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的短期物體識別記憶能力和被動回避反應能力；與野生型小鼠相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Aβ斑塊、海馬和血漿中Αβ1-40和Αβ1-42的水平明顯升高，海馬、

11、CA1區(qū)和CA3區(qū)中的尼氏小體數(shù)量明顯降低，給予LW-AFC、美金剛均能夠顯著減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中的Aβ沉積，降低海馬中的Αβ1-42水平，同時LW-AFC還能降低外周血中的Αβ1-42含量。LW-AFC能夠明顯增加海馬中，特別是CA3區(qū)中的尼氏小體數(shù)量。該結果表明，LW-AFC能夠顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學習記憶能力，并明顯減少腦中Aβ斑塊和神經(jīng)元丟失，同時降低腦和血液中的可溶性Aβ水平。
　　3. LW-

12、AFC對自然衰老SAMR1小鼠延緩衰老的作用研究
　　使用12月齡和24月齡的SAMR1小鼠作為衰老小鼠模型，分別灌胃給予褪黑素（melatonin）（1mg/kg）和LW-AFC（1.6g/kg），7月齡的SAMR1小鼠和ICR小鼠作為對照。3個月后進行老化評分、生存期、體重變化、自主活動、空間學習記憶等指標檢測。結果顯示，12和24月齡SAMR1小鼠的老化評分要明顯高于對照組7月齡的SAMR1小鼠和ICR小鼠，給予LW-AFC

13、能夠分別在給藥30天和45天后，顯著降低12和24月齡SAMR1小鼠的老化評分；LW-AFC能夠明顯提高12月齡SAMR1小鼠的生存率和平均生存天數(shù)，以及12和24月齡SAMR1小鼠的平均體重；LW-AFC能夠顯著改善12和24月齡的SAMR1小鼠的空間記憶能力。表明LW-AFC能夠延緩自然衰老SAMR1小鼠的衰老進程。
　　第二部分 LW-AFC改善中樞學習記憶功能的作用機理研究
　　1. LW-AFC對SAMP8小鼠NI

14、M網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)作用
　　為觀察LW-AFC對SAMP8小鼠NIM網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)作用，采用3H-TdR摻入法檢測SAMP8小鼠脾細胞的增殖能力，流式細胞術檢測脾淋巴細胞亞型，液相蛋白芯片技術檢測血漿中細胞因子的含量，放射免疫法、化學發(fā)光法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測HPA軸和HPG軸中激素水平的變化。結果表明，SAMP8小鼠NIM網(wǎng)絡的功能明顯紊亂，給予1.6g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能夠顯著降低SAMP8小鼠下丘腦中CRH水平；0.

15、8g/kg和1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著降低SAMP8小鼠下丘腦中GnRH水平、垂體中ACTH、LH和FSH水平；0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能夠顯著提高血漿中T水平，而美金剛僅能降低LH的水平。
　　對于SAMP8小鼠的脾淋巴細胞增殖，美金剛和多奈哌齊能夠明顯提高Con A和 LPS刺激的SAMP8小鼠的脾淋巴細胞增殖能力，此外多奈哌齊還能顯著提高其脾淋巴細胞的自發(fā)增殖能力，而0.8g/k

16、g、1.6g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能夠明顯提高自發(fā)和Con A刺激的增殖能力，0.8g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能夠顯著提高LPS刺激的脾淋巴細胞增殖能力。
　　對于 SAMP8小鼠的脾淋巴細胞亞型，給予美金剛和 LW-AFC（0.8g/kg和1.6g/kg）能夠顯著提高CD3+CD4+T細胞的表達量，多奈哌齊和LW-AFC（0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg）能夠顯著提高CD8+CD28+T細

17、胞的表達量，美金剛、多奈哌齊和LW-AFC（0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg）能夠顯著提高CD19+B細胞的表達量；美金剛、多奈哌齊和LW-AFC（0.8g/kg和1.6g/kg）能夠顯著提高CD19+CD80+B細胞的表達量，美金剛和多奈哌齊明顯降低了CD3+CD8+T細胞的表達量。多奈哌齊顯著提高了 SAMP8小鼠血液中 CD4+CD25+Foxp3+T細胞的表達量，而 LW-AFC（1.6g/kg）則能夠明顯降低其表

18、達量。此外，美金剛、多奈哌齊和LW-AFC（0.8g/kg和1.6g/kg）能恢復CD4+/CD8+的平衡。
　　對于SAMP8小鼠血液中的細胞因子水平，給予SAMP8小鼠美金剛，能夠顯著降低其血液中IL-23、TNF-β和eotaxin的水平，多奈哌齊僅能夠降低IL-23的水平，LW-AFC（0.8、1.6和3.2 g/kg）則能夠明顯降低IL-1β、IL-23、GM-CSF、IFN-γ、eotaxin、TNF-α、TNF-β的

19、水平，升高MCP-1的分泌水平，而0.8g/kg和1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著降低IL-2、IL-6和RANTES的水平，1.6g/kg的LW-AFC還能夠明顯提高IL-5的水平。
　　這些結果提示，LW-AFC能夠有效恢復或改善SAMP8小鼠HPA軸和HPG軸平衡，并通過增強淋巴細胞增殖能力、恢復失衡的淋巴細胞亞型、調(diào)控異常分泌的細胞因子等途徑，調(diào)節(jié)或改善免疫功能，進而對SAMP8小鼠處于平衡失調(diào)、功能紊亂狀態(tài)的NIM網(wǎng)

20、絡發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，改善或恢復其平衡狀態(tài)。
　　2. LW-AFC對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠NIM網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)作用
　　為觀察LW-AFC對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠NIM網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)作用，采用放射免疫法、化學發(fā)光法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠HPA軸和HPG軸的變化；液相蛋白芯片技術檢測血漿中細胞因子的含量。結果表明，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的NIM網(wǎng)絡平衡紊亂，給予美金剛和LW-AFC能夠顯著降低APP/PS1轉(zhuǎn)基

21、因小鼠的垂體中的ACTH水平；LW-AFC能夠明顯降低下丘腦中的GnRH、垂體中的FSH和LH的水平，美金剛則能夠顯著降低FSH和LH的水平。美金剛、多奈哌齊和 LW-AFC都能夠顯著提高 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠脾細胞上清液中CD8+CD28+T細胞的表達量，美金剛和 LW-AFC則能夠明顯降低CD4+CD25+Foxp3+T細胞的表達量。美金剛能夠顯著降低 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠血液中IL-1β、IL-6、IL-23、GM-CSF

22、和TNF-β的水平，多奈哌齊僅能降低IL-1β的水平，LW-AFC則能夠顯著降低IL-1β、IL-2、IL-6、IL-23、GM-CSF、TNF-α、TNF-β和eotaxin的分泌水平，同時還能夠明顯提高IL-4和G-CSF的水平。該結果表明，LW-AFC能夠調(diào)節(jié)或改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠NIM網(wǎng)絡的功能紊亂。
　　3. LW-AFC對自然衰老SAMR1小鼠NIM網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)作用
　　為觀察LW-AFC對衰老動物模型NI

23、M網(wǎng)絡中“免疫衰老”的作用，采用3H-TdR摻入法檢測高月齡SAMR1小鼠脾細胞的增殖能力；流式細胞術檢測脾淋巴細胞亞型；液相蛋白芯片技術檢測血漿中細胞因子的含量。結果表明，12和24月齡的SAMR1小鼠都具有一定程度的免疫功能低下和慢性炎癥。給予褪黑素和LW-AFC能夠顯著提高12月齡 SAMR1小鼠脾細胞的自發(fā)增殖能力，同時褪黑素和 LW-AFC還能夠提高12和24月齡SAMR1小鼠Con A和LPS刺激的脾細胞增殖能力。對于脾淋巴

24、細胞亞型，褪黑素能夠明顯恢復12和24月齡的SAMR1小鼠CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞和CD19+B細胞的表達量以及12月齡SAMR1小鼠的CD4+/CD8+的比值和24月齡SAMR1小鼠CD4+CD25+Foxp3+T細胞的表達量；LW-AFC能顯著恢復12和24月齡的SAMR1小鼠 CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞和CD19+B細胞的表達量，同時還能改善24月齡的SAMR1小鼠CD3+T細胞、CD4+

25、/CD8+和CD4+CD25+Foxp3+T細胞的表達紊亂。褪黑素能夠明顯改善12月齡SAMR1小鼠外周血中9個促炎因子（eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、RANTES、TNF-α）以及全部抗炎因子（G-CSF、IL-4、IL-5、IL-10）的水平異常，也能改善24月齡SAMR1小鼠外周血中8個促炎因子（GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-17、RANTES、TNF-

26、α、TNF-β）和1個抗炎因子（IL-4）的水平異常；給予LW-AFC能夠顯著改善12月齡SAMR1小鼠外周血中11個促炎因子（eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、RANTES、TNF-α、IL-23、TNF-β）以及全部抗炎因子（G-CSF、IL-4、IL-5、IL-10）的水平異常，也能夠改善24月齡SAMR1小鼠外周血中12個促炎因子（eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL

27、-1β、IL-2、IL-6、IL-17、MCP-1、RANTES、TNF-α、IL-23、TNF-β）的水平異常，但對抗炎因子無效。該結果提示，LW-AFC能夠通過調(diào)節(jié)高月齡SAMR1小鼠的免疫功能低下，降低慢性炎癥，延緩SAMR1小鼠的免疫衰老。
　　4. LW-AFC對NIM網(wǎng)絡的作用靶點分析
　　為深入研究LW-AFC改善SAMP8小鼠和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠認知功能的作用靶點。采用Pearson相關性分析的方法，對

28、SAMP8小鼠和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠NIM網(wǎng)絡中激素、細胞因子與其認知功能相關性進行了研究與分析，發(fā)現(xiàn)NIM網(wǎng)絡與認知功能具有相關性；采用多重線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)內(nèi)分泌方面，HPG軸中的LH、T和GnRH與SAMP8小鼠的認知功能相關；HPG軸的T和LH，HPA軸中的ACTH與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認知功能相關。在細胞因子方面，Th1細胞分泌的細胞因子（GM-CSF、IFN-γ、IL-2、TNF-α），IL-23，趨化因子（

29、eotaxin、RANTES）與 SAMP8小鼠的認知功能相關；Th2細胞分泌的細胞因子(GM-CSF、IL-6)，趨化因子（eotaxin）與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認知功能相關。對于SAMP8小鼠，LW-AFC可調(diào)節(jié)與認知功能緊密相關的分子為：GnRH、LH、T、GM-CSF、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-23、eotaxin、RANTES。對于APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，LW-AFC可調(diào)節(jié)與認知功能緊密相關的分子為：AC

30、TH、LH、GM-CSF、IL-6、eotaxin。提示這些分子有可能是LW-AFC防治AD的潛在作用靶標，對不同的AD動物模型，LW-AFC能夠通過作用于不同的靶點，改善不同原因所導致的認知功能損傷。
　　通過以上研究，本研究主要得出以下結論：
　　1. LW-AFC能夠改善SAMP8小鼠和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的主動、被動回避反應能力、空間學習記憶能力和物體識別記憶能力；此外，能降低自然衰老SAMR1小鼠的老化度評分、

31、延長生存期，表明長期口服給予LW-AFC對AD模型動物學習記憶功能具有明顯改善作用，并具有明顯抗衰老作用。
　　2. LW-AFC能夠明顯改善SAMP8小鼠和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠所表現(xiàn)的HPA軸和 HPG軸平衡失調(diào)，糾正或改善淋巴細胞亞型分布及細胞因子分泌異常；此外，改善和調(diào)節(jié)自然衰老SAMR1小鼠免疫功能，表明長期口服給予LW-AFC對AD模型動物神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫功能紊亂均具有明顯調(diào)節(jié)作用。
　　3. LW-AFC能夠

32、改善多種模型動物學習記憶功能、改善神經(jīng)內(nèi)分泌及免疫功能。對于 SAMP8小鼠，LW-AFC主要通過作用于 GnRH、LH、T、GM-CSF、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-23、eotaxin和 RANTES改善認知；對于APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，LW-AFC則主要作用于ACTH、LH、GM-CSF、IL-6、eotaxin。提示LW-AFC對改善AD模型小鼠中樞學習記憶功能的作用是通過調(diào)節(jié)NIM網(wǎng)絡平衡而發(fā)揮的。
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