應(yīng)用基因譜系示蹤技術(shù)揭示小鼠Tbx18+EPCs向心系細(xì)胞分化潛能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分，Tbx18-Cre基因敲入小鼠的繁殖和鑒定
　　基因工程小鼠在認(rèn)識(shí)基因的功能、建立人類遺傳性疾病的動(dòng)物模型方面被認(rèn)為是最佳動(dòng)物模型。在整體動(dòng)物表型水平研究胚胎心臟發(fā)育過程及心肌損傷修復(fù)中，基因工程小鼠也是目前最流行和有效的功能基因組研究手段。利用基因譜系示蹤技術(shù)研究心臟祖細(xì)胞的分化命運(yùn)，更是關(guān)鍵技術(shù)手段。但是，基因工程小鼠的品系繁殖及基因型鑒定需要成熟的技術(shù)平臺(tái)。T-box轉(zhuǎn)錄因子18(Tbx18)是T-box家族的重要

2、轉(zhuǎn)錄因子之一，對(duì)哺乳動(dòng)物心臟發(fā)育形成起重要的調(diào)節(jié)作用。如何示蹤胚胎心臟發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄因子Tbx18為標(biāo)記的細(xì)胞群的分化命運(yùn)，存在一定技術(shù)難度。利用Tbx18-Cre Knock in小鼠和Cre報(bào)告小鼠建立Tbx18-Cre/Rosa26RYFP/LacZ磁雙雜合Knock in小鼠模型，為解決示蹤Tbx18為標(biāo)記的心臟祖細(xì)胞群分化命運(yùn)難題的可行方案。
　　目的：優(yōu)化提取基因組的方法，建立快速大批量鑒定、篩選Tbx18-Cre K

3、nock in雜合子小鼠的研究平臺(tái)，為建立雙雜合基因譜系示蹤模型提供關(guān)鍵技術(shù)保障。
　　方法：將Tbx18-Cre Knock in雜合子雄性小鼠與同背景的C57BL/6雌性小鼠交配，應(yīng)用新的一管酒精基因組抽提法，篩選、鑒定出一批子代雜合Tbx18-Cre Knock in小鼠。通過凝膠電泳基因組DNA和分光光度法檢測(cè)DNA純度和濃度、酶切全基因組、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)判斷一管酒精抽提法的基因組質(zhì)量。Tbx18-Cre子代鼠通

4、過PCR鑒定，根據(jù)雜合子陽性率判定遺傳信息是否符合孟德爾遺傳規(guī)律，初步判斷是否存在基因遺漏現(xiàn)象。
　　結(jié)果：(1)經(jīng)過基因組電泳分析DNA質(zhì)量、分光光度法檢測(cè)DNA純度，顯示一管酒精抽提法提取的基因組與經(jīng)典酚/氯仿提取法提取的基因組質(zhì)量沒有明顯差別；兩者模板都能成功應(yīng)用PCR擴(kuò)增來鑒定基因敲入小鼠；酶切全基因組后，兩種方法獲得的基因組都可以被酶完全切開。(2)利用一管酒精抽提法提取的基因組，PCR擴(kuò)增鑒定Tbx18-Cre子代鼠，

5、陽性率為51.6％，基本符合孟德爾遺傳規(guī)律。Rosa26EYFP和Rosa26LacZ的子代陽性小鼠比例也基本符合孟德爾遺傳規(guī)律。
　　結(jié)論：(1)利用一管酒精抽提法提取的基因組，基因組質(zhì)量良好，用于PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)果穩(wěn)定、可靠；酶切反應(yīng)完全，還可以用于Southern雜交等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。因此，我們成功建立快速、大批量鑒定、篩選轉(zhuǎn)基因小鼠的研究平臺(tái)。(2)我們篩選、鑒定的Tbx18-Cre、Rosa26EYFP、Rosa26La

6、cZ雜合子子代小鼠未發(fā)現(xiàn)基因遺漏現(xiàn)象，這些基因敲入小鼠保種和鑒定成功，為我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了最關(guān)鍵保障。
　　第二部分，胚胎心臟發(fā)育過程中Tbx18+細(xì)胞分化命運(yùn)示蹤模型的建立
　　如何在體內(nèi)、外示蹤轉(zhuǎn)錄因子Tbx18為標(biāo)記的心臟祖細(xì)胞群的分化命運(yùn)，存在一定技術(shù)難度。因此，利用基因譜系示蹤技術(shù)，建立Tbx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ雙雜合小鼠模型，為解決在胚胎心臟發(fā)育過程中示蹤標(biāo)記Tbx18+細(xì)胞分化命運(yùn)難題

7、的可行方案。
　　目的：嘗試通過基因和蛋白兩個(gè)方面鑒定Tbx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ雙雜合Tbx18+細(xì)胞及其分化細(xì)胞示蹤模型是否成功。
　　方法：(1)大體觀察Tbx18Cre/Cre小鼠可導(dǎo)致發(fā)育異常、致死性特征，初步判斷Tbx18-Cre小鼠Cre表達(dá)是否特異。(2)將雌性雜合Tbx18-Cre Knock in小鼠和雄性條件性Cre報(bào)告系統(tǒng)小鼠Rosa26EYFP和Rosa26LacZ交配，在其

8、子代小鼠中PCR法篩選、鑒定Tbx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ雙雜合模型。(3)原位雜交法檢測(cè)胚胎Tbx18mRNA的表達(dá)，X-gal染色檢測(cè)示蹤模型LacZ的表達(dá)，F(xiàn)ACS分選純化EYFP+細(xì)胞。
　　結(jié)果：(1)大體觀察到Tbx18Cre/Cre小鼠導(dǎo)致發(fā)育異常、致死性特征；(2)Tbx18mRNA的表達(dá)部位與Tbx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ雙雜合小鼠模型的報(bào)告基因表達(dá)部位基本一致；(3)

9、通過FACS分選EYFP+細(xì)胞，在體外獲得以轉(zhuǎn)錄因子Tbx18為標(biāo)記的示蹤細(xì)胞系。
　　結(jié)論：(1)Tbx18Cre/Cre小鼠具有knock-in knock-out內(nèi)源性Tbx18的作用，Tbx18Cre小鼠可用于建立Tbx18+細(xì)胞命運(yùn)示蹤模型；(2)早期胚胎Tbx18mRNA的表達(dá)部位與Tbx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ雙雜合小鼠模型的報(bào)告基因表達(dá)部位基本一致，判斷Cre的表達(dá)可特異性反應(yīng)內(nèi)源性Tbx18

10、的表達(dá)，驗(yàn)證該模型可以可靠的在體內(nèi)示蹤Tbx18+細(xì)胞及其分化細(xì)胞命運(yùn)，解決其體內(nèi)示蹤Tbx18為標(biāo)記的心臟祖細(xì)胞群的分化命運(yùn)難題。(3)利用FACS分選純化EYFP+細(xì)胞，最后成功在體外分選出純化的EYFP+細(xì)胞，解決了體外示蹤Tbx18為標(biāo)記的心臟祖細(xì)胞群的分化命運(yùn)難題。
　　第三部分，Tbx18在胚胎心臟發(fā)育過程中的表達(dá)及其命運(yùn)示蹤
　　胚胎心臟心外膜是一種新的心肌細(xì)胞來源。Wt1是心外膜的標(biāo)志，Wt1+心外膜祖細(xì)胞(

11、EPCs)具有向心系細(xì)胞分化的多潛能性。但是，Tbx18是否定位于心外膜，Tbx18+EPCs是否存在還不明確。因此，闡明Tbx18+EPCs質(zhì)疑問題具有重要意義。
　　目的：闡明Tbx18是否定位于早期胚胎心臟的心外膜，進(jìn)而在組織水平揭示Tox18+心外膜是否可以分化形成心肌。
　　方法：原位雜交法檢測(cè)早期胚胎心臟Tbx18mRNA的定位；免疫熒光和X-gal染色分別檢測(cè)示蹤模型EYFP和LacZ的定位；免疫熒光雙標(biāo)和免疫

12、組化雙標(biāo)檢測(cè)Tbx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ模型心外膜的性質(zhì)。
　　結(jié)果：(1)整胚原位雜交染色顯示Tbx18mRNA在E11.5天前小鼠胚胎前體心外膜和心外膜表達(dá)；組織切片提示E11.5天前Tox18mRNA表達(dá)定位在心外膜表達(dá)，心肌組織中沒有Tbx18mRNA的表達(dá)。(2)整胚Tbx18-Cre/Rosa26LacZ小鼠X-gal染色顯示LacZ表達(dá)于E11.5前前體心外膜及心外膜；組織切片提示LacZ表達(dá)

13、定位在E11.5天前心外膜表達(dá)，心肌組織中沒有LacZ的表達(dá)。(3)E11.5天前Tbx18-Cre/Rosa26YFP小鼠EYFP蛋白表達(dá)于心外膜，心肌內(nèi)沒有EYFP蛋白的表達(dá)；E11.5天前心外膜免疫熒光雙標(biāo)揭示EYFP陽性組織不與cTNT陽性組織融合。(4)E11.5天后Tbx18-Cre/Rosa26LacZ小鼠胚胎心臟LacZ在心房、心室、室間隔、心臟血管表達(dá)。利用免疫組化雙標(biāo)法提示E16.5天胚胎心臟Tbx18蛋白與心外膜表

14、達(dá)的報(bào)告基因LacZ重疊，而室間隔等心肌內(nèi)部沒有Tbx18蛋白的表達(dá)。室間隔表達(dá)的LacZ代表由心外膜細(xì)胞分化形成，而非Tbx18蛋白原位表達(dá)所致。
　　結(jié)論：(1)E11.5天前Tbx18mRNA表達(dá)定位在心外膜，此階段小鼠心外膜是具有非心肌組織性質(zhì)；而心肌組織中沒有Tbx18的表達(dá)；因此，Tbx18是胚胎心外膜的標(biāo)志之一。(2)Tbx18-Cre/Rosa26LacZ小鼠模型提示E11.5天后胚胎心房、心室、室間隔、冠狀血管等

15、心臟組織可來源于Tbx18+心外膜。
　　第四部分，胚胎心臟Tbx18+EPCs向心系細(xì)胞分化潛能的實(shí)驗(yàn)研究
　　心臟祖細(xì)胞是具有向心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心臟起搏細(xì)胞等主要心系細(xì)胞多潛能分化特性的細(xì)胞群。心臟Tbx18+EPCs是否具有心系細(xì)胞多向潛能分化特性，對(duì)判定其是否是一種心臟祖細(xì)胞類型具有重要意義。
　　目的：在細(xì)胞水平揭示Tbx18+EPCs是否具有心臟祖細(xì)胞的心系多潛能分化特性。
　　方法：利用T

16、bx18-Cre/Rosa26REYFP/LacZ示蹤小鼠模型，通過免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，鑒定心臟組織中來源于Tbx18+EPCs的細(xì)胞類型及性質(zhì)。
　　結(jié)果：來源于Tbx18+EPCs的心臟組織細(xì)胞可表達(dá)肌鈣蛋白cTNT、平滑肌肌球蛋白重鏈MYH11蛋白、HCN4蛋白，但是不能表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白(VE-cadherin)。
　　結(jié)論：來源于Tbx18+EPCs的心臟組織細(xì)胞具有心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心臟起搏細(xì)胞的特性

17、，但不具有血管內(nèi)皮細(xì)胞的特性。因此，Tbx18+EPCs具有向心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心臟起搏細(xì)胞等心系細(xì)胞分化的多潛能性。
　　第五部分，Tbx18+EPCs對(duì)成年小鼠心臟形成的影響
　　成年小鼠的心臟屬于終末分化組織，目前還沒有證明其具有再生潛能。胚胎、新生、成年期小鼠心臟組織細(xì)胞的特性區(qū)別較大。胚胎和新生小鼠心臟組織的研究結(jié)果不能完全代表成年心臟組織的特性。Tbx18+心外膜參與成年小鼠心臟組織具體什么結(jié)構(gòu)的形成，以

18、及來源于Tbx18+心外膜的成年心臟組織是否具有心系細(xì)胞特性，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　目的：揭示Tbx18+心外膜對(duì)成年小鼠心臟組織不同結(jié)構(gòu)形成的影響，并驗(yàn)證來源于Tbx18+心外膜的成年心臟組織是否具有心系細(xì)胞特性；進(jìn)一步判定多少成年小鼠心臟組織來源于Tbx18+EPCs。
　　方法：整體和組織切片X-gal染色檢測(cè)成年心臟組織LacZ的表達(dá)；免疫熒光雙標(biāo)鑒定來源于Tbx18+心外膜的成年心臟組織特性；FACS法分離Tbx

19、18-Cre/Rosa26EYFP成年小鼠EYFP+細(xì)胞。
　　結(jié)果：成年Tbx18-Cre/Rosa26LacZ/EYFP小鼠心臟LacZ/EYFP表達(dá)于心臟的心室肌、心房肌、冠狀動(dòng)脈、室間隔、瓣膜；LacZ/EYFP陽性組織同時(shí)可表達(dá)肌鈣蛋白cTNT；三只成年Tbx18-Cre/Rosa26EYFP心臟組織細(xì)胞用FACS分離，分選的EYFP+細(xì)胞比例數(shù)值分別為：31.07％、34.77％、35.98％，平均33.94％。