檸檬提取物對變異鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響.pdf

1、目的：本研究定量檢測不同濃度檸檬提取物處理后各組變異鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase，GTF)編碼基因gtfB，gtfC、gtfD的表達(dá)水平的變化，從mRNA水平探討檸檬提取物對變異鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響，對檸檬提取物發(fā)揮抗齲作用的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探討，為今后開發(fā)天然、無毒副作用、新型的生態(tài)防齲制劑提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.測定檸檬提取物(lemon peel

2、 extract，LPE)對變異鏈球菌的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)選取變異鏈球菌UA159為實(shí)驗(yàn)菌株，采用液體稀釋法測定LPE對變異鏈球菌的MIC。
　　 2.測定LPE對變異鏈球菌生長曲線的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)組為MIC以下三個濃度的LPE溶液，陽性對照組為0.05％洗必泰，陰性對照組為不加藥的TPY液體培養(yǎng)基，每組3個平行管。將濃度為1×108CFU/ml的

3、菌懸液與各組TPY液體培養(yǎng)基按體積比1:10比例接種，置于恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱中37℃厭氧培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、0.5及1、2、4、6、1h、24 h提取菌液，活菌計數(shù)法計算活菌數(shù)，用菌落形成單位數(shù)的對數(shù)(log CFU/ml)為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，作圖繪制生長曲線。
　　 3.測定LPE對變異鏈球菌葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響。
　　 三個濃度LPE溶液組設(shè)計同上，空白對照組為不加LPE的TPY液體培養(yǎng)基。用無菌生理

4、鹽水調(diào)制成在540nm波長處吸光度OD為1.0的菌懸液，置于恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱中37℃下厭氧培養(yǎng)16h后收集四組菌液，每組三個平行管。用Omega細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取細(xì)菌總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時熒光定量PCR方法測定不同濃度LPE處理后變異鏈球菌的gtfB、gtfC，gtfD基因的表達(dá)量，16SrRNA為內(nèi)參照。Ct值統(tǒng)計分析采用2-△△CT公式計算方法，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)輸入和分析，各組總體均數(shù)之間比較采用

5、單因素方差分析(ANOVA)；采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)行各樣本組間均數(shù)的兩兩比較；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.檸檬提取物對變異鏈球菌的MIC值為4.500 mg/ml。
　　 2.不同濃度LPE組較之空白對照組在細(xì)菌生長30分鐘后抑制細(xì)菌生長作用明顯，作用持續(xù)到24h；隨著LPE濃度的增加，對變異鏈球菌生長的抑制作用增強(qiáng)；0.05％的洗必泰在加藥30分鐘后

6、抑菌作用優(yōu)于LPE，但30分鐘之后變異鏈球菌未見生長。
　　 3.從0.562mg/ml到2.250mgl/ml的LPE溶液組，隨著LPE濃度的逐漸升高，LPE組gtfB、gtfC、gtfD的mRNA表達(dá)水平呈下降趨勢，與空白對照組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 4.相同濃度LPE組的三種基因間表達(dá)水平兩兩比較，0.562mg/mlLPE組變異鏈球菌gtfC的表達(dá)水平最高，gtfB的表達(dá)水平最低，基因間

7、表達(dá)水平兩兩比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；1.125mg/mlLPE組變異鏈球菌gtfB、gtfD的表達(dá)水平低于gtfC，gtfB、gtfD表達(dá)水平兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；2.250mg/ml LPE組gtfB、gtfC、gtfD的表達(dá)水平相當(dāng)，兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.三種濃度的LPE溶液均能有效抑制變異鏈球菌的生長。
　　 2.三種濃度的

8、LPE溶液均能明顯抑制變異鏈球菌gtfB、gtfC，gtfD三種基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。
　　 3.從0.562mg/ml到2.250mgl/ml的LPE溶液組，隨著濃度的逐漸升高，LPE對變異鏈球菌gtfB、gtfC、gtfD的抑制作用逐漸增強(qiáng)。
　　 4.0.562mg/ml LPE溶液對三種基因的抑制作用強(qiáng)度是gtfB>gtfD>gtfC，1.125mg/ml LPE溶液對gtfB，gtfD的抑制作用強(qiáng)于gtfC，2.