花生四烯酸和二十碳五烯酸合成途徑的構建及大豆種子特異性啟動子的改造.pdf

1、多不飽脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，尤其是超長鏈多不飽和脂肪酸(Very long chain polyunsaturated fatty acids，VLC-PUFAs)，具有十分重要的生理功能，是維持人體健康所必需的。通常情況下PUFAs主要來源于深海魚油和海洋藻類，但是由于過度捕撈，海洋污染以及藻類生產(chǎn)PUFAs價格的昂貴，因此迫切需要尋找一種PUFAs的替代來源。
　　 隨

2、著轉基因技術的迅速發(fā)展，利用轉基因的油料作物生產(chǎn)PUFAs被認為是一種十分有前景的的替代來源。大豆是最主要的油料作物之一，含有非常豐富的亞油酸(Linoleic acid，LA)和α-亞麻酸(α-Linolenic acid，ALA)，它們分別占大豆中總脂肪酸的55％和13％，是合成花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)的前體。因此，大豆是通過代謝工程生

3、產(chǎn)ARA和EPA的重要宿主。在轉基因植物中，ARA和EPA生物合成的A6途徑已經(jīng)被廣泛研究了，但△8途徑僅在擬南芥中進行研究并且不是種子特異性表達。由于在轉基因植物中ARA和EPA生物合成的△6途徑存在復雜的底物轉換瓶頸，因此，在本研究中，我們分別在釀酒酵母和大豆中重構ARA和EPA生物合成的△8途徑，構建出產(chǎn)ARA和EPA的釀酒酵母工程菌和無選擇標記基因的轉基因大豆；同時對BCSP952啟動子進行改造，以便提高轉基因大豆中ARA和EP

4、A的合成效率。
　　 首先，分別從球等鞭金藻H29(Isochrysis galbana H29)、小眼蟲藻FH277(Euglena gracilis FH277)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)中克隆出△8途徑中的三個基因△9延長酶基因IgASE2、A8脫氫酶基因efd2和△5脫氫酶基因ptd5，并在釀酒酵母INVSc1中鑒定它們的功能。IgASE2基因長1653 bp，包括一個786 bp

5、的ORF(Open reading frame)、一個44 bp的5'-UTR(Untranslatedregion)和一個823 bp3’-UTR。該基因編碼的延長酶IgASE2與已經(jīng)報道的延長酶IgASE1的氨基酸序列有87％的相似性。IgASE2在釀酒酵母中表達時，能分別將LA和ALA轉化成二十碳二烯酸(ω6-eicosadienoic acid，EDA)和二十碳三烯酸(ω3-eicosatrienoic acid，EtrA)，L

6、A和ALA的轉化率分別是57.6％和56.1％，表明IgASE2基因是一個新的C18-△9專一性的PUFAs延長酶基因。efd2基因ORF長1266 bp，編碼421個氨基酸，它與已經(jīng)報道的EFD1的氨基酸序列相似性為96％。efd2基因在釀酒酵母中表達時，催化底物EDA和EtrA轉化成二高γ-亞麻酸(dihomo-γ-linolenic acid，DGLA)和二十碳四烯酸(eicosatetraenoic acid，ETA)的轉化效率

7、分別約為31.2％和46.3％，表明efd2是一個位置專一性的A8脫氫酶基因。ptd5基因ORF長1410 bp，編碼469個氨基酸。它在釀酒酵母中表達時，催化DGLA和ETA生成ARA和EPA的效率分別約28.7％和37.2％，表明ptd5是一個位置專一性的A5脫氫酶基因。
　　 然后，利用克隆的IgASE2、efd2和ptd5基因，分別在釀酒酵母和大豆中構建了ARA和EPA生物合成的A8(ω6-△8，ω3-△8)途徑，獲得了

8、產(chǎn)ARA和EPA的釀酒酵母工程菌和無選擇標記基因的轉基因大豆。根據(jù)ARA和EPA生物合成的△8(ω6-△8，ω3-△8)途徑，將該途徑中所需要的三個目的基因IgASE2、efd2和ptd5的表達盒有機集合在一起，構建成釀酒酵母共表達載體pYAE5。將該表達載體pYAE5轉化至釀酒酵母INVScl，構建成釀酒酵母工程菌YAE985。該菌在添加外源底物LA和ALA的誘導培養(yǎng)基中誘導表達后，產(chǎn)生的ARA和EPA分別占總脂肪酸含量的1.6％和2

9、.5％，LA轉化成ARA以及ALA轉化成EPA的最終轉化率分別是10.1％和16.9％。這些結果表明，在釀酒酵母中成功地構建了ARA和EPA生物合成的△8(ω6-△8，ω3-△8)途徑。
　　 利用RT-PCR(Real Time PCR)對工程菌YAE985的遺傳穩(wěn)定性進行了檢測，結果表明：工程菌連續(xù)轉接20次后，IgASE2、efd2和ptd5基因在轉錄水平仍然保持1:1:1的關系，說明沒有發(fā)生遺傳重組和目的基因部分丟失的情

10、況，因此釀酒酵母工程菌YAE985具有很好的遺傳穩(wěn)定性。
　　 用大豆種子特異性啟動子BCSP952分別構建基因IgASE2、efd2和ptd5的表達盒，并克隆進表達載體pBX，構建成通過△8(ω6-△8，ω3-△8)途徑生物合成ARA和EPA的無選擇標記轉基因大豆的表達載體pX9AE5。用根瘤農桿菌介導的方法進行大豆轉化，篩選出含有△8(ω6-△8，ω3-△8)生物合成途徑的轉基因大豆。然后對陽性轉化植株進行雌二醇誘導，進一步

11、篩選出無選擇標記的轉基因大豆。轉基因大豆種子中ARA和EPA的含量分別占總脂肪酸含量的6.8％和3.6％。這些結果表明，在無選擇標記的轉基因大豆中成功地構建了ARA和EPA生物合成的△8(ω6-△8，ω3-△8)途徑。
　　 最后，為了提高轉基因大豆中ARA和EPA的合成水平，本文對BCSP952進行了功能分析。在此基礎上，對BCSP952進行改造，以提高BCSP952的強度。為了分析BCSP952的功能，分別構建了BCSP95

12、2的5'-端缺失啟動子片段BCSP666、BCSP471、BCSP285和BCSP156。將它們連接到pBI121質粒的GUS基因上游后轉化擬南芥并通過GUS組化檢測和GUS酶活性測定來鑒定這些啟動子的功能。結果表明：BCSP666的活性與BCSP952活性基本相同，達到BCSP952活性的96.5％；BCSP471的活性次之，約為BCSP952活性的69.4％；BCSP285和BCSPl56的活性相對較低，僅為BCSP952活性的15

13、.5％和10.1％：除BCSP156片段外，其余5’-端缺失啟動子片段都具有種子特異性。說明：種子特異性元件的種類和數(shù)量直接影響啟動子的強度；并且，在BCSP952啟動子的轉錄起始位點至上游約-594位這個區(qū)段內，種子特異性啟動子元件的數(shù)量越多，啟動子的活性越強，但是超過這個區(qū)域，增加這些元件的數(shù)量，并不能有效增加啟動子的強度。
　　 為了提高BCSP952的強度，通過在BCSP952啟動子的-140位插入ABRE和Sph元件，

14、構建成啟動子BCSP952-aa、BCSP952-as和BCSP952-ss，并將它們轉化至擬南芥中進行功能鑒定。GUS組化檢測和GUS活性測定表明：GUS基因只在種子中表達，說明改造后的啟動子是種子特異性的啟動子；BCSP952-as控制的GUS活性最高，約為BCSP952的180％、BCSP952-aa控制的GUS活性次之，約為BCSP952的112％、BCSP952-ss控制的GUS活性反而降低，約為BCSP952的88％。然后，

15、從每種類型的啟動子中選擇GUS活性最高的4個株系進行southern雜交和RT-PCR分析。Southern雜交表明，含有BCSP952-ss的一個株系的GUS基因是雙拷貝，其余啟動子的株系中GUS基因都是單拷貝。RT-PCR分析表明：BCSP952-as控制的GUS基因轉錄水平最高，BCSP952-aa次之，BCSP952-ss最低，這與測定的GUS活性是一致的。這些結果說明：通過對BCSP952進行改造，提高了BCSP952的強度；