心衰標志物NT-proBNP高效免疫傳感器檢測的關鍵技術研究.pdf

1、N 末端前鈉尿肽（NT-proBNP），是從其氨基酸前體蛋白（pro-BNP）中的羧基端裂解而來含76個氨基酸的非活性多肽，是心衰時較好的心臟標志物，能反映心室容積擴大、心室超負荷和心臟功能有無損傷及損傷程度[2-5]。早在2000年“Heart”雜志在一篇名為“BNP：很快成為治療心衰患者的常規(guī)措施”的編者社論中就明確認為腦鈉肽或B 型鈉尿肽(brain natriuretic peptide, B-type natriuretic

2、peptide; BNP)有助于診斷心衰，可作為心衰患者預后標志物，是一種新的監(jiān)控心衰的方法。2002年，國際上已經(jīng)公認腦鈉肽前體，NT-proBNP，是測定心衰的一個劃時代的具有特異性的標志物。目前，NT-proBNP的診斷試劑僅有國外幾家大型醫(yī)療企業(yè)生產(chǎn)，價格昂貴，普及推廣較難。同時，市場上也無出售能直接用于NT-proBNP 檢測的抗體及標準品，因此制備研制NT-proBNP 檢測用抗體及校準品，對彌補國內(nèi)NT-proBNP 檢測

3、試劑空白及改善進口試劑價格高昂的狀況，本身就是一項巨大社會價值和經(jīng)濟價值的工作，同時也為建立具有完全自主知識產(chǎn)權的NT-proBNP 電化學免疫傳感器技術奠定基礎。
　　 近年來基于免疫技術與電化學檢測相結合的免疫傳感器技術已有很大的發(fā)展，該方法不但能定量分析、且有可能開發(fā)出適合社區(qū)醫(yī)院和床旁應用的快速檢測產(chǎn)品，而倍受關注[6]，由于NT-proBNP的正常人血清含量約0.1ng/ml,心衰時可達2-3ng/ml，現(xiàn)有的免疫傳感

4、器技術通常能檢測到0.5ng/ml，建立NT-proBNP 可靠的測定方法應該增敏至正常人血清NT-proBNP 含量的下線左右，以及延長傳感器的使用壽命、解決再生問題和檢測電極的抗干擾能力提高檢測特異性，以達到臨床檢測的要求。為了提高的生物傳感器靈敏度, 近年來，國內(nèi)外一些學者采用不同的標記物來標記抗原或者抗體分子，以提高免疫傳感器的靈敏度，并已取得了較好的進展[7]。在標記物中除了最常用的酶以外，還有金屬或半導體的納米顆粒及其它具有

5、電活性的新型生物材料。我們在研究工作中，我們成功制備了NT-proBNP免疫檢測的抗體及可以應用于臨床的檢測校準品，通過與Roche 試劑臨床檢測對比，符合率達95％以上。在此基礎上，以磁性微粒子偶聯(lián)抗體結合本研究制備的可控磁場電極實現(xiàn)免疫傳感器再生及快速檢驗；通過對抗體的片段化制備高活性的NT-proBNP Fab抗體應用于免疫傳感器檢測消除非標記檢測中的非特異性物質(zhì)的結合帶來的假陽性；采用多層碳納米管(CNTs)為NT-proBNP

6、抗體的固相載體提高抗體吸附的表面積，以及金納米鏈與辣根過氧化物酶復合物與配對NT-proBNP抗體結合的形式信號放大提高了檢測靈敏度。通過以上研究，我們解決了NT-proBNP免疫傳感器檢測中的一些關鍵問題，為建立NT-proBNP免疫傳感器檢測技術，進一步實現(xiàn)NT-proBNP的臨床免疫傳感器檢測產(chǎn)品研究奠定了基礎。
　　 主要的研究內(nèi)容和結果：
　　 1．心衰標志物NT-proBNP免疫檢測用抗體及校準品研究

7、　　 1.1檢測校準品制備及穩(wěn)定性研究
　　 基因重組大腸桿菌（E.coli BL21DE3）中表達的純化的人NT-proBNP蛋白，確定最佳的穩(wěn)定保存形式，結果表明：在含有0.3％ Proclin300的PBS 凍干保存NT-proBNP 6個月后其檢測值僅降低<5％，用小牛血清溶解稀釋后一個月其測定值僅降低<10％，具有良好的保存及檢測結果。
　　 1.2 NT-proBNP 多克隆抗體純化及鑒定
　　 采

8、用多肽偶聯(lián)NHS 活化偶聯(lián)填料建立的親和層析純化及Protein A 普通親和層析結合的方式建立了的NT-proBNP 多抗純化技術，將多抗中含量僅1％的特異性IgG 多抗純化出來，每100毫升免疫血清獲得抗體20毫克左右，純化抗體具有高親和力，同時具有類似單抗的表位特異性。
　　 1.3 NT-proBNP 單克隆抗體的純化及鑒定
　　 預純化的單抗腹水經(jīng)SiO2的吸附處理，經(jīng)改良的Protein A 填料Mabsel

9、ect 純化，純化抗體SDS-PAGE 電泳純度>95％，能有效去除抗體中的脂蛋白提高NT-proBNP 單抗的純度及特異性，更適宜抗體標記及片段化改造。
　　 1.4 NT-proBNP抗體的HRP 標記
　　 通過改良優(yōu)化的HRP 標記方法，制備HRP 標記的NT-proBNP 單克隆抗體，標記的單抗稀釋度達1:1000000，最終確定1:6000的稀釋度應用于雙抗夾心檢測人NT-proBNP，達到臨床檢測效果，標記

10、效果良好。
　　 1.5 雙抗夾心檢測人NT-proBNP 方法學建立及評價
　　 以制備的NT-proBNP 單抗、多抗及檢測校準品建立的NT-proBNP 雙抗體夾心化學發(fā)光檢測試劑盒，其試劑盒檢上限達到30000pg/ml,下限到100pg/ml，通過收集的234份臨床標本與Roche的電化學發(fā)光試劑盒檢測對照，符合率達到99％ (P<0.001)，驗證抗體檢測血清中天然NT-proBNP的能力。
　　 2

11、．心衰標志物NT-proBNP免疫傳感器特異性與免再生研究
　　 2.1NT-proBNP 單克隆抗體Fab抗體的制備及應用
　　 使用木瓜蛋白酶酶切單克隆抗體制備Fab抗體，酶切后采用抗原偶聯(lián)NHS 活化偶聯(lián)填料及Protein A 純化獲得的Fab抗體具有高活性及徹底的除掉Fc 段，采用該方法制備的NT-proBNP Fab抗體純度95％以上，F(xiàn)c 段切除率接近100％。
　　 2.2 Fab抗體應用于提高N

12、T-proBNP免疫傳感器特異性
　　 通過雙單克隆抗體建立的雙抗夾心檢測人NT-proBNP 方法從收集的40例風濕病人血清及216 份陰性體檢血清中分別篩選出6 份和2 份經(jīng)Roche 檢測為陰性的假陽性標本，通過將單克隆抗體Fab 化應用于免疫傳感器檢測，8 份血清均檢測正常，消除了非標記系統(tǒng)免疫傳感器檢測中因風濕因子、補體系統(tǒng)、抗鼠抗體等帶來的假陽性。
　　 2.3 NT-proBNP抗體的生物素化
　　

13、 采用Pierce 生物素化試劑盒對抗體進行生物素化， 選擇EZ-LinkSulfo-NHS-LC-LC-Biotin 標記試劑盒，是一種長臂生物素，分子量為669.75，臂長30.5，提高檢測靈敏度。標記的抗體采用間接ELISA 檢測稀釋度達1:1000000。
　　 2.4免再生NT-proBNP免疫傳感器的構建
　　 以親和素包被磁性微粒子為固相載體，捕獲反應體系中形成的生物素化抗體-抗原-二抗形成的免疫復合物，達

14、到檢測目的。并通過自行設計的可控磁場電極進行檢測、洗脫、再檢測的連續(xù)檢測形式，實現(xiàn)免再生。
　　 2.5基于Fab抗體構建的免再生NT-proBNP免疫傳感器檢測效果評價
　　 在電化學免疫傳感技術研究的基礎上，設計、構建了新型的磁場可控電極，并結合生物素化NT-proBNP Fab抗體、親和素包被磁性微粒子，實現(xiàn)了NT-proBNP 標準品及臨床樣本中NT-proBNP的快速、便捷、免再生檢測。結果顯示，使用該方法構建

15、的免疫傳感器檢測技術靈敏度達到0.03 ng/Ml，線性范圍0.04～2.5 ng/Ml，相關系數(shù)R=0.9827，具有良好的檢測效果；Fab抗體較全抗體消除了收集的8 份假陽性血清；同時，該檢測方法實現(xiàn)了電化學免疫傳感技術由器材向試劑化發(fā)展的轉(zhuǎn)折，便捷化、實用化，為電化學免疫傳感技術向臨床應用過渡研究奠定了工作基礎。
　　 3．心衰標志物NT-proBNP免疫傳感器超敏檢測研究
　　 3.1多層碳納米管(CNTs)固相

16、載體的制備及應用
　　 為了將多層碳納米管能有效的固定與檢測電極表面，我們采用非共價結合的方式先酸處理CNTs，然后結合BSA。結合BSA蛋白的CNTs能被吸附在金電極表面，同時避免用共價方式結合后CNTs 電子傳遞受影響的后果，并且結合BSA后的金電極可進一步與膠體金結合，偶聯(lián)目的抗體分子。通過循環(huán)伏安法（CV）考察，所制備的電極具有良好的電流響應性。
　　 3.2 金納米鏈、辣根過氧化物酶與二抗復合物的制備及應用

17、r>　　 以抗壞血酸為反應媒介，促進HAuCl4溶液與NT-proBNP 二抗及辣根過氧化物酶（HRP）形成鏈狀復合物。通過透射電鏡（TEM）考察其制備效果，結果達到預計效果。對比普通膠體金結合二抗，極大的提高了檢測靈敏度。
　　 3.3基于多層碳納米管及金納米鏈與辣根過氧化物酶復合物構建的NT-proBNP免疫傳感器檢測效果評價
　　 采用多層碳納米管(CNTs)為固相載體提高吸附表面積，增加電極表面一抗固定量，同時

18、以及金納米鏈與辣根過氧化物酶復合物與二抗結合的形式信號放大，達到雙重放大效應，極大的提高了檢測靈敏度。通過循環(huán)伏安法（CV）考察了電極表面的電化學特性，并對該免疫傳感器的性能進行了詳細的研究。研究結果顯示，該傳感器檢測靈敏度達到6pg/Ml，線性范圍為0.02-100ng/Ml（R=0.997），明顯高于NT-proBNP 臨床檢測的靈敏度要求（0.1ng/Ml）。同時對該免疫傳感器也被研究證實具有良好的選擇性和再生性能等，為進一步研究