鏈霉菌JK-1的鑒定及其防病潛能和防病機(jī)制的研究.pdf

1、鏈霉菌一類具有廣泛實(shí)際用途和巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的微生物類群,它廣泛的存在于不同的自然生態(tài)環(huán)境中,種類繁多,代謝功能各異。在目前發(fā)現(xiàn)的數(shù)萬(wàn)種微生物來(lái)源的活性物質(zhì)中,有近50％的都是來(lái)自于鏈霉菌。鏈霉菌可以產(chǎn)生種類繁多的農(nóng)用抗生素,而且大多數(shù)已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用,可防治真菌、細(xì)菌、線蟲(chóng)病害以及一些重要的害蟲(chóng),有的還具有除草活性。本試驗(yàn)室在2007年7月發(fā)現(xiàn)了一株對(duì)稻瘟病菌有很強(qiáng)拮抗作用的鏈霉菌菌株JK-1,通過(guò)形態(tài)學(xué),生理生化鑒定以及16SrD

2、NA序列分析,將其鑒定為球孢鏈霉菌(Streptomyces golobisporus)。在此基礎(chǔ)之上進(jìn)一步對(duì)球孢鏈霉菌JK-1的防病潛能和防病機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定以及16S rDNA分析,將菌株JK-1鑒定為球孢鏈霉菌(Streptomyces golobisporus)。
　　 2.研究了不同培養(yǎng)條件對(duì)鏈霉菌JK-1生長(zhǎng)及其產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的影響。結(jié)果表明,

3、在供試的7種培養(yǎng)基中,LB最有利于菌體生長(zhǎng),PSB最有利于產(chǎn)生抗菌物質(zhì)。該菌在10-35℃范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)并產(chǎn)生抗菌物質(zhì),25℃為菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的最適溫度。鏈霉菌JK-1在PSB中培養(yǎng)6d菌體干重和抑菌活性均可達(dá)到最大值；適宜于JK-1生長(zhǎng)及其產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的pH值范圍為5-11,最適為pH6-8。該菌能夠有效的利用多種碳源和氮源進(jìn)行生長(zhǎng)和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)。其中分別以甘油為碳源和酪氨酸為氮源時(shí)生長(zhǎng)最好；以麥芽糖為碳源和硫酸銨為氮源時(shí)產(chǎn)

4、生抗菌物質(zhì)最多。
　　 3.研究了鏈霉菌JK-1產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,鏈霉菌JK-1產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在高溫下和蛋白酶K處理的情況下活性顯著降低,在酸性條件比較穩(wěn)定,而pH≥12的堿性條件容易失活。硫酸銨可以將發(fā)酵液中的抗菌物質(zhì)沉淀下來(lái),超濾發(fā)現(xiàn)其分子量大于10 KD。
　　 4.研究了球孢鏈霉菌JK-1對(duì)稻瘟病菌的抑制作用及其防病效果,發(fā)現(xiàn)球孢鏈霉菌的發(fā)酵液能夠抑制稻瘟菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)以及附著胞形成。分別將

5、鏈霉菌JK-1的菌體懸浮液、發(fā)酵液、發(fā)酵濾液與稻瘟菌分生孢子液混合接種,發(fā)現(xiàn)濃度為108CFU/mL的菌體懸浮液、濃度為10％的發(fā)酵液和發(fā)酵液濾液均能完全抑制稻瘟病的發(fā)生。溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明,在噴霧接種稻瘟菌前12 h和接種后2 h噴霧發(fā)酵濾液,其防病效果分別為89.1％和88.3％。利用組織學(xué)和掃描電鏡觀察了球孢鏈霉菌發(fā)酵濾液對(duì)稻瘟病菌在水稻葉片上侵染過(guò)程的影響,結(jié)果表明,在接種后3 h前噴霧JK-1發(fā)酵濾液能抑制稻瘟病菌分生孢子的

6、萌發(fā)以及附著胞的形成,從而控制稻瘟病的發(fā)生。
　　 5.研究了鏈霉菌JK-1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)番茄灰霉病的防病效果及其作用機(jī)制,結(jié)果表明揮發(fā)性物質(zhì)可以抑制灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)以及孢子形成,且隨JK-1麥粒培養(yǎng)物量的增加其抑菌活性逐漸增強(qiáng)。在接種后不同時(shí)間對(duì)番茄進(jìn)行熏蒸處理,發(fā)現(xiàn)接種后立即用120 g/L的鏈霉菌麥粒培養(yǎng)物熏蒸可以完全抑制灰霉病的發(fā)生。掃描電鏡結(jié)果表明,揮發(fā)性物質(zhì)能夠抑制灰霉菌分生孢子在番茄果實(shí)上的萌發(fā)以及侵

7、染菌絲形成,并且導(dǎo)致分生孢子和侵染菌絲畸形,從而達(dá)到防治灰霉病的目的。利用二乙酸熒光素(FDA)和碘化丙啶(PI)染色結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)30 g/L,60 g/L和120 g/L,的球孢鏈霉菌麥粒培養(yǎng)物熏蒸處理6 d后分別有59.4％,76.7％和85.3％的分生孢子不能存活。透射電鏡觀察結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)揮發(fā)性物質(zhì)處理的分生孢子和菌絲細(xì)胞內(nèi)的液泡數(shù)量明顯增多,部分孢子細(xì)胞壁增厚,菌絲細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離,細(xì)胞的完整性被破壞。
　　 6.研

8、究了鏈霉菌JK-1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)柑橘青霉菌的抑制作用及其防病效果。結(jié)果表明,揮發(fā)性物質(zhì)可以抑制柑橘青霉菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)以及孢子形成,并且可有效控制柑橘青霉病的發(fā)生。采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)分析,從鏈霉菌麥粒培養(yǎng)物產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)中鑒定出41種揮發(fā)性有機(jī)化合物,這些物質(zhì)分別屬于烴類、酯類、醇類、酮類、醚類、有機(jī)酸等。從中選擇了8種特殊的化合物進(jìn)行了抑菌活性及防病效果測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲基二硫醚、二甲基三硫醚和苯乙酮能抑制