吡格列酮對(duì)高脂血癥大鼠主動(dòng)脈NOS-NO和AdipoR的影響.pdf

1、高脂血癥(Hyperlipemia,HL)是動(dòng)脈粥樣硬化形成的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素,動(dòng)脈粥樣硬化早期升高的氧化低密度脂蛋白和膽固醇可對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜功能性損傷,影響內(nèi)皮功能。內(nèi)皮在維持血管完整性有著重要的作用,內(nèi)皮損傷在動(dòng)脈粥樣硬化病程中有著始發(fā)作用,與動(dòng)脈粥樣硬化、急性冠脈綜合癥、高血壓等多種心血管疾病發(fā)展和病理有著密切聯(lián)系。動(dòng)脈粥樣硬化過程進(jìn)行性發(fā)展會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重心腦血管突發(fā)事件,患者預(yù)后差,嚴(yán)重影響生存及生活質(zhì)量。早期干預(yù)血脂所致的動(dòng)脈損傷,并

2、修復(fù)血管,阻斷動(dòng)脈粥樣硬化病情進(jìn)展,在控制心血管急性事件發(fā)生中有著重要的作用。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化早期變化為內(nèi)皮損害,一氧化氮合酶(NOS)表達(dá)及相關(guān)輔助因子系統(tǒng)改變,導(dǎo)致一氧化氮(NO)破壞增加,NO的合成減少,內(nèi)皮依賴性舒張功能調(diào)節(jié)失衡,可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成。通過合理升高NO水平能夠改善內(nèi)皮功能,從而阻止動(dòng)脈粥樣硬化病情進(jìn)展。脂聯(lián)素(ADP)是一個(gè)與體脂含量呈負(fù)相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子,已證實(shí)其具有廣泛的生物學(xué)活性,如抗炎,增加

3、胰島素敏感性等,低脂聯(lián)素血癥日漸成為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。脂聯(lián)素受體(AdipoR)1/2調(diào)節(jié)脂聯(lián)素調(diào)節(jié)的胰島素敏感性,AdipoR1/2表達(dá)于骨骼肌和肝臟,其可能在調(diào)節(jié)ADP抗炎作用,改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。過氧化物酶體增生物激活受體γ(PPARγ)作為轉(zhuǎn)錄因子屬于核受體超家族。吡格列酮為PPARγ激動(dòng)劑,不僅能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,而且能通過抑制血管的炎癥反應(yīng)、提高纖維溶解系統(tǒng)活性、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能,降低C反應(yīng)蛋白質(zhì)水平。但其改善主動(dòng)脈血

4、管功能機(jī)制尚不明確。因此筆者采用高脂飲食建立高脂血癥大鼠主動(dòng)脈損傷模型,探討吡格列酮對(duì)高脂血癥大鼠主動(dòng)脈損傷進(jìn)程的干預(yù)作用及機(jī)制,為吡格列酮抗動(dòng)脈粥樣硬化提供理論支持。
　　 目的:通過觀察吡格列酮對(duì)高脂血癥大鼠血漿脂聯(lián)素(ADP)、主動(dòng)脈一氧化氮(NO)、抑制型一氧化氮合酶(iNOS)、結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(cNOS)、總一氧化氮合酶(tNOS)的改變和脂聯(lián)素受體(AdipoR)的表達(dá)改變及吡格列酮的干預(yù)影響,探討吡格列酮可能的

5、作用機(jī)制,為吡格列酮抗提供理論依據(jù)。
　　 方法:前12周,27只雄性SD大鼠經(jīng)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為兩組,隨機(jī)分為正常對(duì)照組9只、高脂飲食組18只,進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)。12周后,存活的造模組17只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為模型組、吡格列酮組。對(duì)照組喂以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料,造模組依據(jù)給予高脂飲食(膽固醇2％、膽酸鹽0.5％、甲基硫氧嘧啶0.2％和72.3％基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng),喂養(yǎng)12周后,第12周末從眼眶后靜脈抽血檢測(cè)血脂水平以確定模型是否復(fù)制成功,

6、并檢測(cè)血糖(blood glucose,BG)水平。隨后將高脂飲食組大鼠隨機(jī)分為模型組和吡格列酮組,吡格列酮組:吡格列酮10mg·kg-1·d-1連續(xù)灌胃,對(duì)照組和模型組:雙蒸水灌胃,1.5 ml/100g體重,1次/日；均灌胃4 w。給藥4周后,禁食24小時(shí),于次日上午8時(shí),用20％氯胺酮,以l ml/100g劑量麻醉后,剪開胸腹腔,暴露心臟,左心室穿刺取血5 ml,室溫靜置1小時(shí)后,3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘,分離血清置-20℃冰箱保

7、存,待測(cè)血清指標(biāo)；于冰盤中分離主動(dòng)脈,并在主動(dòng)脈弓與胸主動(dòng)脈交界處取材,用10％中性甲醛固定作HE病理檢測(cè),剩余主動(dòng)脈組織置液氮中保存待測(cè)其他指標(biāo)。
　　 吡格列酮干預(yù)4周后,檢測(cè)各組血脂水平,三酰甘油(TG)用TPO-PAP法檢測(cè),總膽固醇(TC)用CHOD-PAP法檢測(cè),低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)用選擇性沉淀法檢測(cè),并檢測(cè)BG。用伊紅染色法、免疫組化染色顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞后采用光鏡觀察、

8、電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清ADP、硝酸還原法測(cè)血清和主動(dòng)脈NO、精氨酸催化法檢測(cè)主動(dòng)脈tNOS、iNOS及cNOS(等于tNOS與iNOS之差)的水平。蛋白免疫印跡雜交法測(cè)主動(dòng)脈脂聯(lián)素受體1和2蛋白水平、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)主動(dòng)脈脂聯(lián)素受體1和2基因表達(dá)。光鏡和電鏡觀察主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變。主動(dòng)脈NOS-NO,脂聯(lián)素及其受體下降可能介入高脂血癥血管損傷,吡格列酮具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用,該作用可能與提高血清ADP和主動(dòng)脈血

9、管AdipoR表達(dá)有關(guān)。
　　 統(tǒng)計(jì)方法:統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS13.0進(jìn)行分析,定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示；兩組資料比較若方差齊,用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),若方差不齊,用Welch校正t檢驗(yàn)；多組間比較用完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)資料的方差分析,若方差齊,則采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,若方差不齊用Dunnett's T3檢驗(yàn)。P≤0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.大鼠血脂、血糖變化吡格列酮干預(yù)前,造模

10、后第12周高脂飲食組TG、TC、LDL-C較對(duì)照組明顯升高(P<0.01),HDL-C、BG高脂飲食組較對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.091,P=0.884)。經(jīng)吡格列酮干預(yù)4周后,模型組較正常對(duì)照組TG、TC明顯升高(p<0.01),吡格列酮組較模型組TG、TC顯著下降(P<0.01)；TG、TC吡格列酮組較對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.562,P=0.931)。對(duì)照組、模型組、吡格列酮組間HDL-C、LDL-C、BG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、意義(P=0.884,P=0.177.P=0.860),但吡格列酮組HDL-C有升高趨勢(shì)。
　　 2.大鼠主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變
　　 2.1.主動(dòng)脈病理HE染色形態(tài)改變對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)皮未見明顯改變,內(nèi)皮保持連續(xù)性、內(nèi)膜完整、未見平滑肌增厚；模型組出現(xiàn)脂質(zhì)沉積,部分內(nèi)膜增厚,平滑肌紊亂、增生,內(nèi)皮斷裂,缺如；吡格列酮組內(nèi)膜及平滑肌未見明顯改變。
　　 2.2.光鏡顯示形態(tài)學(xué)改變第八因子相關(guān)CD31抗體顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞后

12、采用光鏡觀察,對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮光滑平整,平滑肌組織分布均勻。模型組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮組織大部脫落,平滑肌明顯增生,排列紊亂,細(xì)胞肥大,垂直于內(nèi)膜。吡格列酮組主動(dòng)脈內(nèi)皮基本完好,偶有脫落,平滑肌細(xì)胞增殖不明顯,排列規(guī)則,形態(tài)基本正常。
　　 2.3.電鏡血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變對(duì)照組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞正常,胞漿內(nèi)線粒體正常,胞核結(jié)構(gòu)正常,內(nèi)彈力膜連續(xù),厚薄均勻,平滑肌細(xì)胞正常。模型組大鼠內(nèi)皮細(xì)胞病變較重,胞膜破裂,胞質(zhì)脫失、外溢或疏

13、松變性,胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器溶解或消失,胞核染色質(zhì)疏松,電子密度減低,核膜不完整；內(nèi)皮下纖維母細(xì)胞增生變,膠原纖維增多。內(nèi)彈力膜中斷,厚薄不一,有灶性溶解,中膜平滑肌細(xì)胞脂質(zhì)沉淀,呈泡沫樣改變。吡格列酮組大鼠血管內(nèi)皮層整齊,內(nèi)皮細(xì)胞幾乎正常,偶見內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體水腫,中膜的平滑肌細(xì)胞偶有線粒體水腫及泡沫樣變。
　　 3.主動(dòng)脈NO和NOS活力的改變模型組主動(dòng)脈NO水平低于對(duì)照組(P<0.01)；而吡格列酮組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

14、=0.490)；吡格列酮組與模型組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；模型組較對(duì)照組cNOS下降(P<0.01),吡格列酮組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.444)吡格列酮組較模型組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過經(jīng)完全隨機(jī)化方差分析得出各組間iNOS、tNOS活力改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.389,P=0.189)。
　　 4.血漿ADP水平改變模型組血漿ADP較對(duì)照組脂聯(lián)素水平明顯下降(P<0.01),吡格

15、列酮組血漿ADP水平明顯升高(P<0.05)。吡格列酮組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.518)。
　　 5.主動(dòng)脈AdipoRmRNA和AdipoR蛋白表達(dá)模型組AdipoR1mRNA水平低對(duì)照組(P<0.01),吡格列酮組與模型組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,高于模型組(P<0.01),對(duì)照組與吡格列酮組間未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.062)。模型組AdipoR2mRNA水平低于對(duì)照組(P<0.01),吡格列酮組與對(duì)照組比較未見

16、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.191),吡格列酮組與模型組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,高于模型組(P<0.01)。模型組AdipoR1蛋白水平低對(duì)照組(P<0.01),吡格列酮組與模型組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,高于模型組(P<0.05)。吡格列酮組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.182)。模型組AdipoR2蛋白水平低于對(duì)照組(P<0.01),吡格列酮組與對(duì)照組比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.068),吡格列酮組與模型組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,高于模型組(P<0.01

17、)。
　　 結(jié)論
　　 1.高脂飲食造成高脂血癥出現(xiàn),大鼠TG、TC、LDL-C顯著增高,成功復(fù)制了高脂血癥大鼠模型；病理顯示血管內(nèi)皮斷裂,缺如,內(nèi)膜增厚,平滑肌紊亂、增生。
　　 2.觀察到模型組大鼠主動(dòng)脈NO、cNOS水平下降,血漿ADP的濃度顯著下降,同時(shí)熒光實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blotting結(jié)果顯示主動(dòng)脈AdipoRmRNA及其蛋白合成減少；
　　 3.吡格列酮能明顯改善高脂血癥大鼠