HMGA2調(diào)節(jié)Atg12-Atg5的形成在鉻誘導(dǎo)自噬中的機(jī)制研究.pdf

1、鉻(Cr)，作為一種銀灰色金屬，在自然界中存在二價(jià)、三價(jià)和六價(jià)三種價(jià)態(tài)。六價(jià)鉻毒性最大，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)1990年就將六價(jià)鉻列為確認(rèn)的I類致癌物。大量流行病學(xué)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，暴露在環(huán)境中的六價(jià)鉻化合物與多種癌癥和腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)。研究表明，低劑量的六價(jià)鉻可以誘導(dǎo)自噬，其機(jī)制是通過吞噬腫瘤細(xì)胞受損的細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)蛋白，并將其降解成細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)再循環(huán)利用，維持腫瘤細(xì)胞活性，提高腫瘤細(xì)胞增殖率，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。自噬可以誘發(fā)腫瘤

2、，并為其提供一個(gè)低氧氣和營(yíng)養(yǎng)限制的條件，此過程需要自噬相關(guān)蛋白（ATG）協(xié)調(diào)參與。HMGA2在不同的生物學(xué)過程中具有關(guān)鍵意義。HMGA2在許多惡性腫瘤中過表達(dá)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)氯化鎘（CdCl2）通過誘導(dǎo) ROS的形成引起了HMGA2表達(dá)上調(diào)，而HMGA2表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致了MRC-5細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的變化。我們也發(fā)現(xiàn)了，氯化鎘引起細(xì)胞增殖的濃度同樣誘導(dǎo)了細(xì)胞發(fā)生自噬?，F(xiàn)階段沒有文獻(xiàn)報(bào)道 HMGA2在自噬中的作用，且低劑量重鉻酸鉀誘導(dǎo)自噬

3、的機(jī)制也在探索階段。因此，本研究以重鉻酸鉀作為研究對(duì)象，探討HMGA2在重鉻酸鉀所引起的自噬中的作用。
　　目的：研究低濃度的重鉻酸鉀對(duì)自噬的影響，及 HMGA2在重鉻酸鉀誘導(dǎo)自噬中的可能分子機(jī)制。
　　方法：本研究以人肺腺癌細(xì)胞（A549細(xì)胞）和人胚腎細(xì)胞（HEK293細(xì)胞）作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以BALB/c小鼠作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。BALB/c小鼠經(jīng)重鉻酸鉀處理后，利用蛋白質(zhì)印跡法觀察小鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白、HMGA1和 HM

4、GA2蛋白的表達(dá)情況。利用透射電子顯微鏡檢測(cè)重鉻酸鉀對(duì)小鼠肺組織自噬小體數(shù)量的影響。利用MTT法檢測(cè)重鉻酸鉀對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖率的影響，及自噬干預(yù)劑3-MA預(yù)處理后染毒重鉻酸鉀的A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖率的變化。利用吖啶橙染色和透射電子顯微鏡觀察重鉻酸鉀對(duì) A549細(xì)胞自噬溶酶體和自噬小體數(shù)量的影響，利用蛋白質(zhì)印跡法觀察自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。運(yùn)用siRNA干擾技術(shù)，檢測(cè) HMGA2對(duì)重鉻酸鉀所引起的細(xì)胞自噬的影響。利用吖啶橙染色和

5、透射電子顯微鏡觀察HMGA2對(duì)重鉻酸鉀處理的A549細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體和自噬小體數(shù)量的影響，利用蛋白質(zhì)印跡法觀察HMGA2對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響，qPCR實(shí)驗(yàn)觀察 HMGA2對(duì) Atg5和 Atg12基因的表達(dá)情況的影響。在 HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)入pcDNA3.1-HMGA2質(zhì)粒，通過蛋白質(zhì)印跡法觀察HMGA2對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。
　　結(jié)果：重鉻酸鉀處理的BALB/c小鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白（LC3II、p62、Atg12-

6、Atg5、Atg4、Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1）、HMGA1和HMGA2蛋白的表達(dá)量均升高（P＜0.05，P＜0.01）。透射電子顯微鏡觀察的結(jié)果也顯示染毒組小鼠肺組織自噬小體數(shù)量增加（P<0.01），說明重鉻酸鉀誘導(dǎo)BALB/c小鼠肺組織自噬。低濃度重鉻酸鉀（0.1、0.2μM）作用A549細(xì)胞24小時(shí)后，吖啶橙染色和透射電子顯微鏡結(jié)果可見細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體和自噬小體數(shù)量的顯著增加（P<0.01），自噬相關(guān)蛋白（LC

7、3II、Atg12-Atg5、Atg4）、HMGA1和HMGA2的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），p62蛋白表達(dá)水平下降。說明低濃度重鉻酸鉀誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬。在HMGA2 siRNA處理的A549細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，自噬溶酶體和自噬小體的數(shù)量減少、LC3II和Atg12-Atg5蛋白表達(dá)水平降低，p62蛋白降解抑制，但Atg5和Atg12蛋白水平無明顯變化。說明HMGA2可能是通過Atg12-Atg5偶聯(lián)蛋白調(diào)控重鉻酸鉀

8、誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。為了證明我們的觀點(diǎn)，利用qPCR實(shí)驗(yàn)，分析證實(shí)Atg5和Atg12基因的表達(dá)量并不隨著HMGA2的變化而改變。在HEK293細(xì)胞中，可以檢測(cè)到隨著HMGA2表達(dá)量的升高，LC3II和Atg12-Atg5蛋白表達(dá)水平升高，p62表達(dá)水平下降，Atg5和 Atg12蛋白的表達(dá)水平無明顯差異。上述結(jié)果表明，HMGA2是通過調(diào)節(jié)Atg12-Atg5偶聯(lián)結(jié)合從而促進(jìn)重鉻酸鉀誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。
　　結(jié)論：HMGA2誘導(dǎo)Atg12