環(huán)境內分泌干擾物二噁英的細胞毒性作用機制研究.pdf

1、環(huán)境內分泌干擾物(EEDs)是我國廣泛存在、危害效應十分嚴重的環(huán)境與食品污染物。目前，EEDs已成為全世界廣泛關注的安全衛(wèi)生問題之一。二嗯英(Dioxin)和多氯聯(lián)苯類(PCBs)化合物是目前國際社會極為關注的持久性有機污染物(POPs)與EEDs。由于它們廣泛分布并共存于環(huán)境中，具有可生物蓄積、難以降解、遠距離遷移及高毒等特性，已成為環(huán)境毒理學研究的熱點；2，3，7，8．四氯二苯并二嗯英(TCDD)是二嗯英類物質中毒性最大、毒作用最為

2、典型、研究中最具有代表性的物質，被公認為世界最強的致癌物。它主要來源于垃圾焚燒，農藥、化肥、除草劑等含氯化合物的生產和使用。TCDD化學性質非常穩(wěn)定，在環(huán)境中普遍存在，近年來相繼發(fā)生了數(shù)起有關二嗯英污染事件，世界各國都極為關注二嗯英對人類健康和環(huán)境安全的潛在威脅。因此，對TCDD的研究已成為一個熱點，對其作用機制有了初步的認識，但對細胞的毒性作用機制尚不完全清楚，對其毒性作用的拮抗研究也報道較少，致使臨床上還未有有效的診治措施。本研究從

3、體內和體外兩個方面研究了TCDD的毒性作用及其機制，并就鋅對TCDD產生毒性效應的保護作用進行了初步探討，旨在為進一步探索臨床防治措施提供一定的理論和實驗依據(jù)。本研究包括二部分：第一部分TCDD與PCBs聯(lián)合作用對大鼠外周血淋巴細胞DNA的影響
　　 本部分實驗應用TCDD和Aroclor1254單獨及聯(lián)合染毒大鼠，采用堿性單細胞凝膠電泳技術檢測TCDD和Aroclor1254對大鼠外周血淋巴細胞DNA完整性的影響，并利用析因設

4、計方差分析判定二者對所檢測的毒理學終點是否存在聯(lián)合作用，初步探討了TCDD和Aroclor1254單獨及聯(lián)合毒性作用及其作用模式，以期為進一步研究二(口惡)英與PCBs的聯(lián)合毒性作用提供一定的毒理學依據(jù)。采用2X2析因設計將20只SD大鼠按體重隨機分為4組，即對照組（給予等體積橄欖油）、Aroclor1254單獨染毒組（10mg/kg）、TCDD單獨染毒組(10 ug/kg)、聯(lián)合染毒組(Aroclor125410mg/kg+TCDD1

5、0ug/kg)，每天灌胃染毒一次，連續(xù)灌胃6d。末次染毒24h后，取外周血，分離淋巴細胞。采用堿性單細胞凝膠電泳技術（彗星試驗）檢測外周血淋巴細胞DNA損傷情況，并采用CASP軟件分析各組彗星的尾部DNA百分含量(TailDNA％)、尾長(Tail Length)、尾矩(Tail Moment)．并利用析因方差分析判定TCDD與Aroclor1254聯(lián)合暴露的聯(lián)合毒性效應的作用模式。結果表明，Aroclor1254單獨染毒組Tail D

6、NA%、Tail Length、Tail Moment與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；TCDD單獨染毒組和聯(lián)合染毒組Tail DNA%、Tail Length、Tail Moment與對照組比較差異顯著(P<0.01)。析因分析結果表明，在本實驗條件下，TCDD與Aroclor1254聯(lián)合作用對大鼠外周血淋巴細胞DNA損傷的影響為協(xié)同作用。第二部分環(huán)境內分泌干擾物二晤英的細胞毒性作用
　　 本部分研究采用TCDD和

7、氯化鋅同時作用于HepG2細胞，通過檢測細胞內活性癢(ROS)、抗氧化物質的含量和抗氧化酶的活性、一些蛋白表達的變化及細胞凋亡情況，探討氧化損傷在TCDD所致的HepG2細胞毒性效應中的作用，并初步探討了鋅對TCDD所致毒性效應的保護作用，為進一步探索臨床防治措施提供理論基礎。分別以不同濃度的TCDD和ZnCI2染毒HepG2細胞，細胞培養(yǎng)24 h后。采用MTT法檢測細胞活力；熒光探針DCFH-DA法檢測ROS:采用TBA法測定細胞中脂

8、質過氧化產物丙二醛(MDA)含量、采用Beutler改良法測定細胞中谷胱甘肽(GSH)含量、采用試劑盒測定細胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性；Hoechst熒光探針檢測細胞凋亡情況；單細胞凝膠電泳實驗檢測細胞DNA完整性；Westem Blot檢測細胞細胞色素P4501A1(CYPIAI)、SODI、SODII和熱休克蛋白70(HSP70)蛋白表達水平。結果表明，TCDD可引起明顯的細胞毒性效應，并呈明顯的劑量-效應關系，表現(xiàn)為：Hep

9、G2細胞活力受到明顯抑制；各染毒組細胞內ROS的生成量明顯高于對照組(p<0.01)、細胞MDA含量隨TCDD濃度的提高而明顯升高(p<0.05)、細胞內GSH含量明顯減少(p<0.05)、細胞內SOD活性顯著降低(p<0.01)：TCDD能夠引起HepG2細胞的DNA損傷，尾部DNA百分含量(Tail DNA%)、尾長(Taillength)、尾矩(Tail moment)隨TCDD染毒濃度提高而增加(p<0.01)；TCDD可誘導H

10、epG2細胞發(fā)生凋亡；TCDD可誘導細胞中CYPIAI和HSP70蛋白表達量明顯高于對照組（p<0．Ol），并使細胞中SODI和SODIl蛋白表達明顯低于對照組（p<0.05）,ZnCl2對TCDD所致的細胞毒性效應具有明顯的保護作用，表現(xiàn)為：ZnCl2能明顯增加HepG2細胞活力；細胞內ROS的生成量明顯低于對照組(p<0.01)、細胞MDA含量明顯降低(p<0.05)、細胞內GSH含量和SOD活性顯著升高(p<0.01)；能明顯減輕

11、TCDD所引起HepG2細胞的DNA損傷，使Tail DNA%、Tail length、Tailmoment減少(p<0.01)；抑制細胞的凋亡發(fā)生；使細胞中CYPIAI和HSP70蛋白表達量明顯低于對照組(P　　 綜合本研究結果，在本實驗條件下，可以得到如下結論：①TCDD可引起大鼠外周血淋巴細胞DNA的損傷，TCDD和Aroclor1254

12、聯(lián)合染毒對大鼠外周血淋巴細胞DNA的損傷更為嚴重。②TCDD能引起HepG2細胞內ROS過量產生，同時降低了細胞抗氧化防御系統(tǒng)的能力，誘導CYPIAI和HSP70蛋白表達升高，使SODⅠ和SODⅡ蛋白表達降低，并最終導致細胞內脂質、DNA發(fā)生氧化損傷及細胞凋亡。表明氧化應激是TCDD引起細胞損傷的重要機制之一。③鋅作為自由基清除劑，對TCDD所引起的抗氧化防徹系統(tǒng)的破壞及其引起的氧化應激反應、細胞凋亡具有一定的保護作用。表明鋅是可以作為