不良狀態(tài)的空腸彎曲菌經(jīng)消化道感染豚鼠致周圍神經(jīng)病變.pdf

1、目的:
　　1.觀察不良生長(zhǎng)狀態(tài)下的空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni）能否經(jīng)消化道感染Hartley豚鼠并致周圍神經(jīng)病變。
　　2.比較兩種不同培養(yǎng)狀態(tài)的空腸彎曲菌感染Hartley豚鼠所致周圍神經(jīng)損傷的差異。
　　3.通過(guò)更為自然的感染途徑，完善空腸彎曲菌致Hartley豚鼠周圍神經(jīng)病的動(dòng)物模型。
　　方法：
　　1.菌株來(lái)源：來(lái)源于空腸彎曲菌菌株庫(kù)中的空腸彎曲菌Lu

2、lei株。
　　2.細(xì)菌復(fù)蘇、培養(yǎng)、鑒定以及制備菌懸液：將保存于-80℃的空腸彎曲菌Lulei株在室溫（25℃）下復(fù)蘇，于42℃微需氧（5％O2，10%CO2，85%N2）氣體培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳至第三代后進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)、生化及分子學(xué)鑒定，將其中一半培養(yǎng)基轉(zhuǎn)置于42℃自然氧（21%O2，1%CO2，78% N2）氣體培養(yǎng)箱中，其余培養(yǎng)基培養(yǎng)環(huán)境保持不變。將兩培養(yǎng)箱中的細(xì)菌分別制成兩種菌懸液，濁度均為3×108CFU/ml，準(zhǔn)備為Hart

3、ley豚鼠灌胃。
　　3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：32只4周齡SPF級(jí)Hartley豚鼠，隨機(jī)分組為2組實(shí)驗(yàn)組和1組空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)環(huán)境的不同分為微需氧組（M組）和自然氧組（N組）,每組12只，共24只；空白對(duì)照組（B組）為8只。
　　4.灌胃方案：實(shí)驗(yàn)組M組每只Hartley豚鼠予以灌胃微需氧條件下培養(yǎng)的空腸彎曲菌菌懸液2ml（濁度為3×108CFU/ml），實(shí)驗(yàn)組N組Hartley豚鼠每只予以灌胃自然氧條件下培養(yǎng)的空

4、腸彎曲菌菌懸液2ml（濁度為3×108CFU/ml），實(shí)驗(yàn)組每隔2天進(jìn)行一次灌胃，總共7次。對(duì)照組B組不給于任何處理。每次灌胃前全部 Hartley豚鼠需禁食12小時(shí)、禁水3小時(shí)，灌胃后給予飼料及水。
　　5.動(dòng)物觀察：自動(dòng)物入籠后每日對(duì) Hartley豚鼠進(jìn)行觀察，包括豚鼠進(jìn)食、運(yùn)動(dòng)、精神、毛發(fā)，是否腹瀉、力弱等，定期測(cè)量體重。使用重復(fù)測(cè)量法分析各組豚鼠的體重變化有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第一次灌胃后參照Hartley豚鼠EAN模型的癱瘓

5、評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，每天觀察Hartley豚鼠的臨床癥狀。
　　6.動(dòng)物解剖及坐骨神經(jīng)染色：末次灌胃后，每隔5天解剖8只豚鼠，每次實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)各選取3只，對(duì)照組隨機(jī)選取2只，解剖共分四次完成。對(duì)Hartley豚鼠進(jìn)行灌注、解剖后取材兩側(cè)坐骨神經(jīng)，坐骨神經(jīng)進(jìn)行再處理后行鋨酸、HE染色。
　　7.神病理觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色病理結(jié)果。經(jīng)餓酸染色后于體視顯微鏡下對(duì)每只Hartley豚鼠隨機(jī)分離100根坐骨神經(jīng)的神經(jīng)單根纖維，

6、于生物顯微鏡下觀察、病理評(píng)估并記錄病變單根纖維數(shù)，計(jì)算每只及每組 Hartley豚鼠坐骨神經(jīng)神經(jīng)單根纖維的病變率（病變率=病變根數(shù)/100×100%）。使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)每組神經(jīng)單根纖維病變率結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，比較各組神經(jīng)單根纖維病變率之間有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察：
　　1.1.臨床癥狀：參照豚鼠EAN模型的癱瘓?jiān)u分標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所有豚鼠評(píng)分均為0級(jí)。對(duì)照組有6只豚鼠發(fā)生明

7、顯毛發(fā)脫失。其余豚鼠未觀察到脫毛、腹瀉、精神萎靡、癱瘓等明顯臨床癥狀。
　　1.2.體重變化：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組豚鼠均出現(xiàn)體重上下浮動(dòng)現(xiàn)象。用重復(fù)測(cè)量法對(duì)各組豚鼠體重進(jìn)行比較，采用雙側(cè)性檢驗(yàn)，可得各組之間體重變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.坐骨神經(jīng)染色觀察：
　　2.1.餓酸染色
　　對(duì)照組豚鼠神經(jīng)可觀察到神經(jīng)單根纖維形態(tài)均勻，髓鞘表面光滑，郎飛氏結(jié)結(jié)構(gòu)正常，偶見(jiàn)髓鞘皺縮;
　　實(shí)驗(yàn)組每只豚鼠神經(jīng)中均可見(jiàn)神經(jīng)損

8、傷，可觀察到神經(jīng)單根纖維粗細(xì)不等，郎飛氏結(jié)結(jié)構(gòu)不同程度缺損，結(jié)旁區(qū)髓鞘脫失、皺縮呈鋸齒狀，髓鞘內(nèi)有片狀或卵圓狀沉積物，偶見(jiàn)華勒樣變性。
　　2.2.HE染色
　　實(shí)驗(yàn)組豚鼠神經(jīng)可觀察到神經(jīng)單根纖維髓鞘脫失，軸索不連續(xù)、斷裂。
　　對(duì)照組豚鼠神經(jīng)可觀察到神經(jīng)單根纖維粗細(xì)均勻，髓鞘光滑，軸索完整。
　　3.神經(jīng)病變率統(tǒng)計(jì)結(jié)果：
　　所有數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)三組神經(jīng)單根纖維病變率結(jié)果

9、進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，雙側(cè)性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。得出：P＜0.05（χ2=217.697，P=0.000），拒絕H0，接受H1，認(rèn)為三組間病變率不全相等，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　為進(jìn)行兩組間的病變率差異比較，采用χ2分割法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，校正后α′=0.0125。各實(shí)驗(yàn)組與同一對(duì)照組的比較可見(jiàn)：M組與B組比較，得出 P＜0.0125（χ2=219.273，P=0.000），拒絕 H0，接受 H1，認(rèn)為 M組與B組病變率

10、不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；N組與B組比較，得出P＜0.0125（χ2=168.772，P=0.000），拒絕H0，接受H1，認(rèn)為N組與B組病變率不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的病變率比較可見(jiàn)：M組與 N組比較，得出P＜0.0125（χ2=6.579，P=0.010），拒絕H0，接受H1，認(rèn)為M組與N組病變率不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傻贸鋈M坐骨神經(jīng)病變率從高到低為：M組>N組>B組，且三組之間病變率比較存在差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

11、r>　　結(jié)論：
　　1.非最佳培養(yǎng)條件（42℃，21%O2，1%CO2，78% N2）下空腸彎曲菌菌株庫(kù)中的Lulei株仍能誘發(fā)Hartley豚鼠發(fā)生周圍神經(jīng)病變。
　　2.微需氧條件（42℃，5%O2，10%CO2，85%N2）下和好氧條件（42℃，21%O2，1%CO2，78% N2）下培養(yǎng)的空腸彎曲菌Lulei株均可導(dǎo)致豚鼠周圍神經(jīng)發(fā)生病變，即實(shí)驗(yàn)組所有豚鼠均發(fā)生了周圍神經(jīng)病變，但每只豚鼠神經(jīng)病變率不一樣。