RUNX3逆轉(zhuǎn)食管鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　本研究擬檢測(cè)RUNX3在食管癌患者腫瘤組織及相應(yīng)細(xì)胞系中的表達(dá)，并探討其與患者臨床病例參數(shù)的相關(guān)性，同時(shí)分析RUNX3和Akt1表達(dá)的變化對(duì)順鉑作用后的食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探究RUNX3逆轉(zhuǎn)食管癌細(xì)胞順鉑耐藥的相關(guān)機(jī)制，旨在為食管癌的臨床診斷以及靶向治療提供可靠依據(jù)。
　　方法：
　　(1)采集103例2009年1月～2012年1月期間就診于山東大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科行食管鱗狀細(xì)胞癌(Ⅱa-Ⅲb期)切除

2、手術(shù)患者癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織，熒光定量PCR檢測(cè)RUNX3 mRNA表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)RUNX3和Akt1蛋白的表達(dá)，分析RUNX3與患者化療耐藥和臨床病例資料的相關(guān)性，分析RUNX3與Akt1的相關(guān)性。
　　(2)構(gòu)建攜帶有RUNX3全基因或siAkt1慢病毒載體，包裝出病毒后感染ESCC細(xì)胞系，熒光定量PCR和western blot檢測(cè)RUNX3的表達(dá);CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期;

3、Hoechst染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;western blot檢測(cè)Akt1、p-Akt1、Bcl-2、Bcl-xl、CyclinD1、P21、Bax蛋白的表達(dá)。
　　(3)將ESCC細(xì)胞中表達(dá)RUNX3及相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)皮下注射裸鼠，隨后經(jīng)腹膜內(nèi)注射順鉑，比較各組小鼠的腫瘤大小抑制腫瘤抑制率。
　　結(jié)果：
　　(1)一般資料分析結(jié)果表明，男性患者與女性患者相比，RUNX3的低表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);在小

4、于56歲的食管鱗狀細(xì)胞癌患者中，RUNX3的低表達(dá)率與大于56歲患者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);在腫瘤浸潤(rùn)程度為T(mén)1～T2期的患者當(dāng)中，RUNX3呈低表達(dá)的患者比例明顯低于T3～T4期患者(P＜0.05);在臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者當(dāng)中，RUNX3呈低表達(dá)的患者比例明顯低于Ⅲ～Ⅳ期患者(P＜0.05);在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者當(dāng)中，RUNX3呈低表達(dá)的患者比例明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P＜0.05)。在化療敏感的食管鱗狀細(xì)胞癌患

5、者癌組織中RUNX3 mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平明顯高于化療不敏感者(P＜0.05)，在未接受輔助化療的患者其癌組織中RUNX3 mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平明顯高于術(shù)前接受過(guò)輔助化療者(P＜0.05)。在RUNX3表達(dá)呈陽(yáng)性的組織中，Akt1的表達(dá)量明顯降低(P＜0.05);在RUNX3表達(dá)為陰性的組織中，Akt1的表達(dá)量則明顯增高(P＜0.05); RUNX3和Akt1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.296，p=0.0042＜0.01）。

6、
　　(2)順鉑耐藥的Eca109和TE-1細(xì)胞中RUNX3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯低于非耐藥Eca109和TE-1細(xì)胞(P＜0.01)。Eca-109 PR R3和Eca-109 PR R3細(xì)胞中RUNX3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯高于Eca-109 PR vector和TE-1PR vector細(xì)胞(P＜0.01)。隨著順鉑濃度的增大，Eca-109 PR vector組和Eca-109 PR R3組、TE-1 P

7、R vector組和TE-1 PR R3組的細(xì)胞活性均逐漸降低，呈劑量依賴性，其中當(dāng)順鉑濃度為100μg/mL時(shí)細(xì)胞活性最低;Eca-109 PR R3組和TE-1 PR R3組細(xì)胞各濃度時(shí)的活性明顯低于TE-1 PR vector組和TE-1 PR vector組(P＜0.05)。隨著順鉑作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Eca-109 PR vector組和Eca-109 PR R3組、TE-1 PR vector組和TE-1 PR R3組細(xì)胞的活性

8、均逐漸增高，呈時(shí)間依賴性，其中當(dāng)順鉑作用后96 h時(shí)細(xì)胞活性最高;Eca-109 PR R3組各順鉑作用時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性明顯低于Eca-109 PR vector組(P＜0.05)。隨著順鉑作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Eca-109 PR R3組和TE-1 PR R3組組細(xì)胞的活性均逐漸增高，呈時(shí)間依賴性，其中當(dāng)順鉑作用后96 h時(shí)細(xì)胞活性最高;Eca-109 PR R3組和TE-1 PR R3組各順鉑作用時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性明顯低于TE-1 PR v

9、ector組和TE-1 PR vector(P＜0.05)。Eca-109 PR R3組和TE-1PR R3組細(xì)胞的IC50濃度明顯低于Eca-109 PR vector組和TE-1 PR vector組(P＜0.05)。Eca-109 PR R3組和TE-1PR R3細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯高于Eca-109 PR vector組和TE-1 PR vector組(P＜0.01)。Eca-109 PR R3組和TE-1 PR R3組細(xì)胞G1期細(xì)

10、胞數(shù)量明顯高于Eca-109 PR vector組和TE-1 PR vector組(P＜0.01)，G2/M期細(xì)胞數(shù)量明顯少于Eca-109 PR vector組和TE-1PRvector組(P＜0.05)。隨著順鉑濃度的增大，Eca-109 PR vector組和 Eca-109 PR siAkt1組、TE-1 PR vector組和TE-1 PR siAkt1組的細(xì)胞活性均逐漸降低，呈劑量依賴性，其中當(dāng)順鉑濃度為100μg/mL時(shí)細(xì)

11、胞活性最低;Eca-109 PR siAkt1組和TE-1 PR siAkt1組各濃度的細(xì)胞活性明顯低于Eca-109 PR vector和TE-1 PRvector(P＜0.05)。Eca-109 PRsiAkt1組和TE-1 PR siAkt1組細(xì)胞的IC50濃度明顯低于Eca-109 PRvector組和TE-1 PR vector組(P＜0.05) Eca-109 PR siAkt1組和TE-1PR siAkt1組細(xì)胞凋亡數(shù)量明

12、顯高于Eca-109 PR vector組和TE-1PRvector組(P＜0.01)。Eca-109 PR siAkt1組和TE-1 PR siAkt1組細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)量明顯高于Eca-109 PR vector組和TE-1 PR vector組(P＜0.01)，G2/M期細(xì)胞數(shù)量明顯少于Eca-109 PR vector組和TE-1 PRvector組(P＜0.05)。Eca-109 PR R3和Eca-109 PR siAkt1

13、組細(xì)胞中Akt1、Bcl-2、Bcl-xl、CyclinD1蛋白的表達(dá)水平明顯低于Eca-109 PR vector和TE-1 PR vector組(P＜0.05);而Eca-109 PR R3和Eca-109 PR siAkt1組細(xì)胞中RUNX3、P21、Bax蛋白的表達(dá)水平則明顯高于Eca-109 PR vector和TE-1 PR vector組(P＜0.05)。
　　(3)Eca-109 PR vector組和Eca-10

14、9 PR R3組裸鼠均成瘤，成瘤率為100％。在治療期間各組裸鼠腫痛體積均隨著時(shí)間推移不斷增大，但Eea-109 PRR3組裸鼠在第18天后各測(cè)量時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積均明顯小于Eca-109 PRvector組(P＜0.05)。隨著時(shí)間推移，各組裸鼠腫瘤體積抑制率均逐漸增高，但Eca-109 PR R3組裸鼠在各測(cè)量時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積抑制率均明顯大于Eca-109 PR vector組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　RUNX3