參附黃注射液對膿毒癥大鼠的器官保護(hù)作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、膿毒癥是具有感染依據(jù)的全身炎癥反應(yīng)綜合癥，是燒創(chuàng)傷、休克、感染等臨床危急重癥患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是誘發(fā)膿毒性休克、多器官功能障礙綜合癥的重要原因。膿毒癥的發(fā)病不僅與炎癥失控相關(guān)，還涉及到免疫系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等以及它們之間的相互作用。目前膿毒癥發(fā)病率居高不下，缺乏行之有效的治療方法，而且成本高昂，成為嚴(yán)重影響生命健康的重要疾患，中西醫(yī)結(jié)合治療可能是提高膿毒癥防治效果的有效途徑之一。 1理論依據(jù)總結(jié)臨床危急重癥救治經(jīng)驗(yàn)

2、，提出對膿毒癥中醫(yī)病因病機(jī)的新認(rèn)識(shí)：外來之毒與內(nèi)生毒邪互結(jié)是主要病因基礎(chǔ)；內(nèi)陷營血是主要病變層次；深入絡(luò)脈是傳變的重要途徑；正虛毒損、絡(luò)脈閉阻是關(guān)鍵病機(jī)變化；扶正解毒通絡(luò)、分層扭轉(zhuǎn)是主要治則。由中藥大黃、附子和紅參提取有效成分，制備參附黃注射液，作為本治法的代表方劑。 2參附黃注射液對膿毒癥動(dòng)物死亡率和器官功能和形態(tài)的影響采用盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)(CLP)復(fù)制膿毒癥大鼠模型，靜脈注射參附黃注射液。雄性Wistar大鼠96只，隨機(jī)分為

3、4組：①正常對照組，n=8；②假手術(shù)組，n=8；③盲腸結(jié)扎穿孔組，n=40，按時(shí)間點(diǎn)分為CLP后2、8、24、48小時(shí)組；④參附黃注射液治療組，n=40，分組同模型組。經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，無菌留取肝、肺、腎組織，冷凍保存?zhèn)溆?。觀察膿毒癥大鼠死亡率、生存時(shí)間和肝、肺臟病理學(xué)改變，檢測肝功、腎功、心肌酶譜和二胺氧化酶水平變化。結(jié)果顯示：治療組術(shù)后72小時(shí)死亡率明顯降低(88.88％vs.67.57％)，術(shù)后48小時(shí)死亡率也有降低趨勢(83.33

4、％vs.62.16％)，治療組生存時(shí)間明顯延長，但兩組死亡率在術(shù)后120小時(shí)和1周的終末觀察點(diǎn)無差別?？梢?，參附黃注射液有改善膿毒癥動(dòng)物預(yù)后的作用，雖然沒有改變死亡的終末結(jié)果，但是延長了生存時(shí)間，為早期救治贏得寶貴的時(shí)機(jī)。治療組動(dòng)物血清ALT、AST、BUN、Cr水平在CLP術(shù)后24小時(shí)和48小時(shí)均有不同程度的下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療組2小時(shí)、24小時(shí)DAO水平有下降趨勢。本藥對心肌酶無明顯影響。肝、肺組織病理學(xué)觀察顯示：治療組組織病

5、理改變程度顯著減輕。參附黃注射液能夠改善膿毒癥動(dòng)物模型的肝、腎器官功能，減輕肝、肺和腸道組織損傷，對膿毒癥動(dòng)物具有一定的器官保護(hù)作用。 3參附黃注射液對膿毒癥動(dòng)物炎癥介質(zhì)基因表達(dá)和蛋白合成的影響采用ELISA試劑盒檢測膿毒癥動(dòng)物血漿和肝、肺組織勻漿中TNF-α、IL-10的蛋白水平，熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測定肝、肺組織TNF-αmRNA、IL-10mRNA表達(dá)。TNF-α是目前已知釋放最早的細(xì)胞因子之一，也是炎癥反應(yīng)的最初觸發(fā)者

6、。結(jié)果顯示：正常組織中有少量的TNF-α蛋白合成，其中肝臟含量多，約為肺臟的70倍。術(shù)后2小時(shí)，肝、肺組織中TNF-α蛋白表達(dá)升高至峰值，其后，肺組織TNF-α水平迅速下降，但于48小時(shí)再度升高，肝組織的TNF-α的升高持續(xù)至8小時(shí)。血漿TNF-α水平術(shù)后2小時(shí)升高；TNF-αmRNA術(shù)后2小時(shí)升高至峰值，其后，基因表達(dá)逐漸降低，至24小時(shí)恢復(fù)至傷前水平。參附黃注射液治療后，肝臟、肺臟和血漿TNF-α蛋白水平和肝臟、肺臟組織TNF-αm

7、RNA基因轉(zhuǎn)錄在術(shù)后2小時(shí)點(diǎn)有不同程度的顯著下降，肺臟TNF-α水平于術(shù)后48小時(shí)也有明顯降低。相關(guān)性分析表明，組織TNF-α基因表達(dá)和蛋白水平呈顯著正相關(guān)，提示TNF-α的誘生主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。 IL-10對免疫應(yīng)答主要起抑制作用，可減少TNF-α、IL-6、IL-8等促炎癥細(xì)胞因子的分泌。正常大鼠組織及血漿中IL-10水平較低，肝組織含量約為肺臟的40倍。CLP術(shù)后2小時(shí)，膿毒癥動(dòng)物血漿IL-10水平迅速升高達(dá)到峰值，隨

8、后下降，術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí)再次顯著上升。肝組織、肺組織IL-10水平從術(shù)后2小時(shí)持續(xù)升高，于術(shù)后48小時(shí)達(dá)到高峰。肝組織IL-10mRNA表達(dá)自術(shù)后2小時(shí)開始升高，一直持續(xù)至術(shù)后48小時(shí)；肺組織自術(shù)后2小時(shí)即出現(xiàn)升高趨勢，術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí)IL-10mRNA表達(dá)明顯升高。相關(guān)性分析表明，組織IL-10基因表達(dá)和蛋白合成水平呈顯著正相關(guān)，提示IL-10的誘生主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。給予參附黃注射液治療后，與同時(shí)間點(diǎn)模型組相比，術(shù)后2

9、4小時(shí)血漿和肺組織IL-10水平明顯下降，術(shù)后48小時(shí)血漿、肝組織和肺組織中IL-10水平降低。術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí)肝組織、肺組織IL-10mRNA表達(dá)顯著下降。 HMGB1是膿毒癥病變發(fā)生發(fā)展過程中一種十分重要的晚期炎癥介質(zhì)，與晚期死亡率密切相關(guān)。采用免疫印跡法(Westernblot)檢測膿毒癥動(dòng)物肝、肺組織HMGB1蛋白合成水平，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測定HMGB1mRNA表達(dá)。自CLP術(shù)后8小時(shí)肝、肺組織HMGB1

10、分泌呈現(xiàn)升高趨勢，24小時(shí)點(diǎn)達(dá)到峰值，直至術(shù)后48小時(shí)仍顯著高于假手術(shù)組。參附黃注射液治療組肝組織HMGB1蛋白水平術(shù)后24小時(shí)有下降趨勢，48小時(shí)點(diǎn)HMGB1水平下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肺組織術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí)點(diǎn)HMGB-1水平下降有顯著性差異。HMGB1mRNA表達(dá)情況與蛋白水平變化基本一致。 4參附黃注射液對膿毒癥動(dòng)物NF-κB活性和蛋白表達(dá)的影響NF-κB是重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，通過調(diào)控多種靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而影響機(jī)體

11、的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA方法測定NF-κB的主要組成部分P65在膿毒癥動(dòng)物肝、肺和腎組織中的活性變化，采用免疫組化染色方法觀察肝、肺組織中NF-κBP65表達(dá)的改變。結(jié)果顯示：膿毒癥大鼠模型從術(shù)后2小時(shí)活性即升高，一直持續(xù)至24小時(shí)，術(shù)后48小時(shí)逐漸恢復(fù)正常。肝組織NF-κBP65活性在2小時(shí)達(dá)到高峰，在肺組織中NF-κBP65活性術(shù)后2小時(shí)和24小時(shí)呈“雙峰”改變，腎組織在術(shù)后24小時(shí)NF-κBP65活性達(dá)到高峰，而后迅速下降

12、。參附黃注射液治療組大鼠肝組織在術(shù)后8小時(shí)活性下降，肺組織在術(shù)后2、24小時(shí)NF-κBP65活性降低，腎組織自8小時(shí)以后NF-κBP65活性持續(xù)降低。免疫組化染色顯示：治療組動(dòng)物肺組織NF-κBP65蛋白表達(dá)減少。 綜上所述，參附黃注射液能延長膿毒癥大鼠模型的生存時(shí)間，保護(hù)肝臟、肺臟的器官功能和結(jié)構(gòu)。其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)失控的炎癥和抗炎級聯(lián)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的：參附黃注射液對血漿和肝、肺組織中的早期炎癥介質(zhì)TNF-α、晚期炎癥介質(zhì)HMG

13、B1和抗炎介質(zhì)IL-10的基因表達(dá)和蛋白合成都有不同程度的抑制作用，調(diào)節(jié)其向正常水平的恢復(fù)。多種炎性介質(zhì)的改變與細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)，參附黃注射液可以抑制肝、肺、腎組織中NF-κB活性和局部蛋白表達(dá)水平，通過降低炎性介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，調(diào)控B細(xì)胞和T細(xì)胞在感染部位的增殖和分化、影響細(xì)胞凋亡和粘附等過程，從而調(diào)控膿毒癥中重要的炎癥和免疫反應(yīng)，改善膿毒癥的預(yù)后。參附黃注射液對炎癥和抗炎反應(yīng)的調(diào)控作用與其具有的解毒通絡(luò)功效相關(guān)。

14、本課題創(chuàng)新點(diǎn)在于：1在理論和文獻(xiàn)研究基礎(chǔ)上，總結(jié)導(dǎo)師臨床經(jīng)驗(yàn)，對膿毒癥發(fā)生發(fā)展的中醫(yī)病因、病變層次、傳變途徑、關(guān)鍵病機(jī)變化等進(jìn)行了歸納總結(jié)，首次提出“扶正解毒通絡(luò)”治療膿毒癥的治則治法新觀點(diǎn)，為中醫(yī)治療膿毒癥提供了新思路和借鑒；2從改善預(yù)后、保護(hù)器官功能和組織形態(tài)、抑制機(jī)體過度炎癥反應(yīng)和抑制炎癥介質(zhì)基因表達(dá)和蛋白合成、影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子活性和蛋白表達(dá)等多方面，從結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系揭示中醫(yī)“扶正解毒通絡(luò)”治療膿毒癥治則治法的科學(xué)內(nèi)涵，對臨床