雞白細(xì)胞介素18雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、白細(xì)胞介素18(Interleukin-18，IL-18)主要由單核-巨噬細(xì)胞系分泌，在結(jié)構(gòu)上屬于IL-1家族，在功能上與IL-12相似，而且與IL-12有協(xié)同效應(yīng)，是重要的調(diào)節(jié)先天性免疫和獲得性免疫的細(xì)胞因子。評(píng)價(jià)IL-18在機(jī)體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化水平，對(duì)于了解傳染性疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸情況及其機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)動(dòng)態(tài)規(guī)律有著重要的意義，本課題組也已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了雞IL-18的轉(zhuǎn)錄水平與家禽腫瘤病毒感染之間存在的相關(guān)性。鑒于此，有必要建立檢測

2、IL-18蛋白在機(jī)體中水平變化的方法。迄今為止，盡管國內(nèi)外已有多種動(dòng)物的商品化IL-18夾心ELISA試劑盒，但尚未見有國產(chǎn)的雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin-18，mChIL-18)夾心ELISA試劑盒。本研究旨在利用重組ChIL-18蛋白(recombinant ChIL-18，rChIL-18)和識(shí)別不同表位的抗ChIL-18單克隆抗體(mAb)建立ChIL-18雙抗體夾心ELISA檢

3、測方法，從而為監(jiān)測雞體免疫狀態(tài)和研究雞體免疫機(jī)制提供技術(shù)平臺(tái)。
　　 將實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的含有mChIL-18基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-mChIL18在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)，采用Ni-NTA親和層析方法純化重組蛋白，免疫BALB/c小鼠，經(jīng)融合、篩選制備特異性單克隆抗體，并通過間接ELISA、間接免疫熒光(IFA)和Western-blot等方法對(duì)mAb做初步鑒定。結(jié)果表明，試驗(yàn)成功表達(dá)了mChIL-18蛋白，并最終獲

4、得1株持續(xù)且穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞(1B10)，其腹水ELISA效價(jià)為1∶3.2×104，亞類鑒定結(jié)果為IgM。Western-blot結(jié)果顯示，單抗能特異性識(shí)別原核表達(dá)的mChIL-18蛋白，IFA分析表明單抗能與真核表達(dá)的mChIL-18發(fā)生特異性反應(yīng)。將1B10與實(shí)驗(yàn)室已制備的針對(duì)不同抗原表位的另外2株單克隆抗體(1G9、2E6)通過ELISA疊加試驗(yàn)進(jìn)行抗原表位分析，結(jié)果表明，1B10與1G9針對(duì)同一抗原表位。
　　

5、應(yīng)用識(shí)別不同表位的雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白的2株單克隆抗體1G9和2E6，建立檢測mChIL-18的單抗包被-單抗檢測的雙抗體夾心ELISA方法，并利用此方法對(duì)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)人工感染SPF雞體內(nèi)mChIL-18的分泌水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，包被抗體的最佳質(zhì)量濃度為8μg/mL，檢測抗體的工作效價(jià)為1∶800，待檢樣品的最佳稀釋度為1∶400，檢測敏感度可達(dá)31.

6、5pg/mL，與其他細(xì)胞因子等抗原蛋白無交叉反應(yīng);跟對(duì)照組相比，REV感染雞體內(nèi)mChIL-18的表達(dá)量在7d、14d、21d、28d、35d、42d和49d均呈現(xiàn)升高，但只有14日齡時(shí)表現(xiàn)差異顯著(P＜0.05）。
　　 同時(shí)應(yīng)用雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體1G9，建立了檢測mChIL-18的多抗包被-單抗檢測雙抗體夾心ELISA方法，并利用此方法對(duì)前述臨床樣品進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，包被抗體的最佳質(zhì)量濃度為