基于鐵調(diào)素探討左歸丸對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用及機(jī)理.pdf

1、目的：
　　本研究以去卵巢大鼠為骨質(zhì)疏松癥模型，用補(bǔ)腎經(jīng)典方劑—左歸丸進(jìn)行干預(yù)，采用骨密度檢測(cè)、Micro CT、免疫組化法、ELISA等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從鐵調(diào)素對(duì)鐵過(guò)載調(diào)節(jié)作用的角度，部分揭示左歸丸對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用及其機(jī)理，并為闡明“腎主骨”的科學(xué)內(nèi)涵提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　先將60只SPF級(jí)雌性SD大鼠按體重隨機(jī)分為3組:空白對(duì)照組12只，假手術(shù)組12只，造模組36只。造模組大鼠用45mg/kg體重

2、的戊巴比妥鈉麻醉后，施以雙側(cè)卵巢切除(OVX)手術(shù)。假手術(shù)組大鼠只切除卵巢周圍少許脂肪組織。術(shù)后3個(gè)月，再將造模組大鼠按體重隨機(jī)分為3組:模型組（OVX組）、OVX+戊酸雌二醇組（E2組）、OVX+左歸丸組（左歸丸組），每組各12只。分組后開(kāi)始對(duì)各給藥組大鼠灌胄給藥:左歸丸組大鼠灌胃給予左歸丸水煎液，給藥濃度為0.968g生藥/mL，給藥體積為1mL/100g體重，給藥劑量為9.68g生藥/kg體重;E2組大鼠灌胃給予戊酸雌二醇混懸液，

3、給藥濃度為0.018mg/mL，給藥體積為1mL/100g體重，給藥劑量為0.18mg/kg體重。以上給藥，一天一次，連續(xù)6天，休息1天后，再連續(xù)給藥6天，如此給藥3個(gè)月。空白對(duì)照組、假手術(shù)組和模型組大鼠按上法灌胃給予等體積的純凈水。灌胃期間，根據(jù)每周所稱取的體重調(diào)整給藥量。
　　在末次給藥1h后，將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，所取全血靜置1h后，以3000r/min離心20min，取血清，分裝后放在-80℃冰箱保存待測(cè)，用于外周血血

4、清中鐵蛋白(Ferritin)、鐵調(diào)素(Hepcidin)、骨鈣素(BGP)、Ⅰ型膠原(COLⅠ)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP-5b）含量的檢測(cè)。然后，將大鼠迅速處死，取子宮并稱重，測(cè)定子宮系數(shù);取脊椎骨，用于骨密度(BMD)檢測(cè);取右側(cè)股骨，福爾馬林固定，Micro CT掃描，用于骨組織形態(tài)指標(biāo)檢測(cè)，包括骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)及結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI

5、);取右側(cè)脛骨，4％多聚甲醛（含1‰DEPC）固定，制作脫鈣骨冰凍切片，用于骨髓中膜轉(zhuǎn)鐵蛋白1(Fpn1)蛋白表達(dá)的檢測(cè)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，均采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布數(shù)據(jù)兩組以上的比較，采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較，方差齊性的采用其項(xiàng)下的LSD檢驗(yàn);方差不齊的則采用其項(xiàng)下的Dunnett's T3(3)檢驗(yàn);若數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布時(shí)，采用非

6、參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis單因素ANOVA(k樣本)(W)，組間兩兩比較，采用其項(xiàng)下的Stepwise step-down檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1、左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠子宮系數(shù)的影響
　　與假手術(shù)組相比，OVX組、E2組和左歸丸組大鼠子宮系數(shù)皆明顯降低;與OVX組相比，E2組大鼠子宮系數(shù)明顯增高，而左歸丸組與OVX組無(wú)差異。
　　2、左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠腰椎BMD的影響

7、　　OVX組大鼠腰椎BMD較之假手術(shù)組顯著降低;與OVX組相比，E2組和左歸丸組大鼠腰椎BMD顯著增高，但仍顯著低于假手術(shù)組。
　　3、左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠股骨骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響
　　3.1、左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠股骨BV/TV的影響
　　與假手術(shù)組相比，OVX組大鼠股骨BV/TV顯著降低;E2組和左歸丸組大鼠BV/TV比OVX組明顯增高，但仍顯著低于假手術(shù)組。
　　3.2、左歸丸對(duì)卵巢切除

8、所致骨質(zhì)疏松大鼠股骨Tb.N、Tb.Th及Tb.Sp的影響
　　與假手術(shù)組相比，OVX組、E2組和左歸丸組大鼠Tb.N明顯降低，Tb.Sp則明顯增高;與OVX組相比，E2組和左歸丸組大鼠Tb.N均明顯增高，Tb.Sp則明顯降低。各組大鼠Tb.Th無(wú)明顯差異。
　　3.3、左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠股骨SMI的影響
　　與假手術(shù)組相比，OVX組大鼠SMI明顯增高;E2組和左歸丸組大鼠SMI與OVX組相比明顯降低，但

9、仍明顯高于假手術(shù)組。
　　4、左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠外周血血清中Ferritin、Hepcidin、BGP、COLⅠ及TRACP-5b含量的影響
　　4.1、左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠外周血血清中Ferritin、Hepcidin含量的影響
　　與假手術(shù)組相比，OVX組大鼠外周血中Ferritin含量明顯增高，Hepcidin含量則明顯下降;與OVX組相比，E2組和左歸丸綱大鼠Ferritin含量均明顯

10、減少， Hepcidin含量則明顯增高，但與假手術(shù)組相比仍有差異。
　　4.2、左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠外周血血清中BGP、COLⅠ含量的影響
　　與假手術(shù)組相比，OVX組大鼠外周血中BGP及COLⅠ含量均明顯增高;E2組和左歸丸組大鼠BGP及COLⅠ含量均明顯低于OVX組，但左歸丸組COLⅠ含量仍明顯高于假手術(shù)組。
　　4.3、左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠外周血血清中TRACP-5b含量的影響
　　

11、與假手術(shù)組相比，OVX組大鼠外周血中TRACP-5b含量明顯增高;E2組、左歸丸組大鼠TRACP-5b含量與OVX組相比明顯降低。
　　5、左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠脛骨骨髓中Fpn1蛋白表達(dá)的影響
　　OVX組大鼠脛骨骨髓中Fpn1蛋白表達(dá)IOD顯著高于假手術(shù)組;與OVX組相比，E2、左歸丸組Fpn1蛋白表達(dá)IOD顯著降低;但左歸丸組Fpn1蛋白表達(dá)IOD仍明顯高于假手術(shù)組，E2組則與假手術(shù)組無(wú)差異。
　　結(jié)論

12、：
　　(1)切除大鼠卵巢可使骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞，骨密度降低，造成骨質(zhì)疏松癥;而左歸丸可改善骨微細(xì)結(jié)構(gòu)，提高骨密度，對(duì)卵巢切除所致的骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)生治療作用。
　　(2)切除大鼠卵巢可使TRACP-5b以及BGP、COLⅠ的水平增高，呈現(xiàn)出高轉(zhuǎn)換的骨丟失狀態(tài);而左歸丸對(duì)其具有一定的抑制作用，使骨吸收和骨形成趨于平衡，從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的作用。
　　(3)切除大鼠卵巢可使Hepcidin水平降低，骨髓細(xì)胞上的Fpn1內(nèi)陷降