赤紅球菌OA1多環(huán)芳烴降解酶系基因簇結(jié)構(gòu)和功能初探.pdf

1、多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是一類廣泛分布的有機(jī)污染物,其對生態(tài)系統(tǒng)毒性大,自然條件下難降解。如何清除此類污染物是全球最關(guān)注的問題之一,并且多種具有降解和轉(zhuǎn)化PAHs功能的微生物已成為全球研究熱點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)室前期研究中分離得到一株既能高效降解多環(huán)芳烴又能高效降解苯甲酸的赤紅球菌菌株OA1,本實(shí)驗(yàn)對赤紅球菌OA1多環(huán)芳烴降解基因簇的結(jié)構(gòu)和功能等進(jìn)行了初步研究,為利用該類細(xì)菌資源預(yù)防

2、、監(jiān)測和控制環(huán)境多環(huán)芳烴污染及生態(tài)恢復(fù)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
　　利用赤紅球菌OA1作為實(shí)驗(yàn)菌株,用溶菌酶和酚/氯仿抽提法從菌體中提取高質(zhì)量全基因組DNA,經(jīng)過隨機(jī)機(jī)械剪切、T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶末端修復(fù),電泳檢測并回收40kb左右的片段,利用Fast-Link? DNA Ligase連接酶使之與CopyControl pCC2FOS載體連接,再經(jīng)MaxPlax? Lambda Packaging Extracts

3、體外包裝形成噬菌體,之后再轉(zhuǎn)染E.coli EPI300-T1R宿主菌,成功構(gòu)建了滴度為1x104 CFU/ml的赤紅球菌OA1 Fosmid基因組文庫。
　　以NCBI數(shù)據(jù)庫中已報道PAHs生物降解菌的環(huán)羥化雙加氧酶(ring-hydroxylating dioxygenase, RHD)基因的序列為基礎(chǔ),利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物,以赤紅球菌OA1的基因組DNA為模板,擴(kuò)增獲得約為300bp的RHD基因

4、的核心片段。利用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I試劑盒將PCR獲得的OA1-RHD標(biāo)記為探針,并以此作為靶基因在構(gòu)建的基因組文庫中通過菌落原位雜交篩選含有多環(huán)芳烴降解基因簇的陽性克隆,結(jié)果獲得兩個陽性克隆子。
　　對獲得的陽性克隆子抽提質(zhì)粒送樣測序,并對獲得的DNA序列進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測,進(jìn)而找到多環(huán)芳烴降解過程中游途徑的原兒茶酸降解基因簇,其中

5、3,4-雙加氧酶(P34D)編碼基因在該基因簇中占重要位置。根據(jù)P34D的全基因序列設(shè)計特異性引物,經(jīng) PCR擴(kuò)增后連接到含有 T7啟動子的高效表達(dá)載體 pET-30a(+)上,并轉(zhuǎn)化到宿主菌E. coliBL21( DE3)中,成功篩選出P34D的高效表達(dá)重組菌株。通過對重組菌誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了P34D融合蛋白的高效表達(dá),酶活檢測顯示異源表達(dá)的P34D對原兒茶酸有催化降解的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,所發(fā)現(xiàn)的基因簇為原兒茶酸降解基因簇