涼血化瘀方對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡及其吞噬作用影響的研究.pdf

1、目的：
　　 以唐由之研究員經(jīng)驗(yàn)方?jīng)鲅龇綖楦深A(yù)藥物,觀察不同濃度涼血化瘀方中藥及服用了不同劑量涼血化瘀方中藥的大鼠血清(含藥血清)對藍(lán)光誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞凋亡的影響；及該藥物對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬作用的影響。從細(xì)胞生物學(xué)角度探討涼血化瘀方對年齡相關(guān)性黃斑變性的療效機(jī)制,為涼血化瘀方治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1人RPE細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定:用胰酶

2、消化法體外分離人RPE細(xì)胞,進(jìn)行RPE細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng),并觀察細(xì)胞生長情況。采用免疫組化法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　 2適于人RPE細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的涼血化瘀方藥物濃度的篩選:用CCK8法測定加入不同濃度涼血化瘀方中藥粗提物及不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清共同培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞的吸光度值,觀察不同濃度涼血化瘀方中藥及不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清對人RPE細(xì)胞活性的影響。選擇適合進(jìn)行人RPE細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。
　

3、　 3人RPE細(xì)胞光損傷模型的建立:采用波長范圍為470～500nm,光照強(qiáng)度為(2000±500)LUX的藍(lán)光對人RPE細(xì)胞進(jìn)行照射12小時,誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞凋亡。采用流式細(xì)胞技術(shù),以AnnexinⅤ FITC/PI為染料觀察人RPE細(xì)胞的凋亡情況。
　　 4涼血化瘀方對藍(lán)光誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞凋亡的影響:光照前加入不同濃度涼血化瘀方中藥粗提物、不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清及陽性對照藥物(維生素C100umol/L)。

4、采用流式細(xì)胞技術(shù),以AnnexinⅤ FITC/PI為染料,檢測不同濃度的中藥粗提物及不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清對藍(lán)光誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞凋亡的影響。并與陽性對照組進(jìn)行比較。
　　 5涼血化瘀方對人RPE細(xì)胞吞噬作用的影響:用FITC標(biāo)記光感受器外節(jié)膜盤(rod outer segment,ROS)；用DAPI將細(xì)胞染色并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；將不同濃度涼血化瘀方中藥粗提物及不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清干預(yù)的后的人RPE

5、細(xì)胞與標(biāo)記好的ROS共同培養(yǎng)12小時后；熒光顯微鏡照相,用Leica QWIN圖像分析軟件分別測量藥物干預(yù)后的RPE細(xì)胞平均吞噬FITC標(biāo)記后的ROS的熒光面積。
　　 結(jié)果：
　　 1人RPE細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定:原代人RPE細(xì)胞培養(yǎng)過程中,體外分離的人RPE細(xì)胞在2～3天內(nèi)可貼壁生長,生長一周左右出現(xiàn)細(xì)胞集落,10天左右大部分細(xì)胞呈現(xiàn)融合狀態(tài)。原代人RPE細(xì)胞呈扁平、不規(guī)則多角形,細(xì)胞核及核仁呈透明狀,胞漿內(nèi)充滿黑色素顆

6、粒,由于其自身不能產(chǎn)生黑色素,隨著傳代次數(shù)的增加,胞漿內(nèi)黑色素顆粒逐漸減少直至消失。傳至第五代,細(xì)胞呈梭型,類似成纖維細(xì)胞。傳代至第九代細(xì)胞出現(xiàn)增殖緩慢。免疫組化法進(jìn)行細(xì)胞鑒定,S100、CK均為陽性即胞漿均呈棕黃色,未見陰性細(xì)胞。
　　 2適于人RPE細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的涼血化瘀方藥物濃度的篩選:觀察不同濃度涼血化瘀方中藥粗提物及不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清對人RPE細(xì)胞活性的影響。結(jié)果示:終濃度為2mg/ml、200ug/ml

7、、20ug/ml、2ug/ml的涼血化瘀方中藥粗提物組與未加藥物組RPE細(xì)胞吸光度(OD)值比較未見明顯降低,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),即這四個濃度的涼血化瘀方中藥對人RPE細(xì)胞活性無影響,可以用于實(shí)驗(yàn)研究。終濃度為200mg/ml、20mg/ml組與未加藥物組RPE細(xì)胞吸光度(OD)值比較明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),抑制RPE細(xì)胞的活性,不適宜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；終濃度為10％、20％、30％、40％的高、中、低劑量涼血化瘀方

8、含藥血清的RPE細(xì)胞組與無藥血清組RPE細(xì)胞比較吸光度(OD)值比較未見明顯降低,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),即對人RPE細(xì)胞的活性無明顯的影響,可以用于實(shí)驗(yàn)。
　　 3人RPE細(xì)胞光損傷模型的建立:波長范圍為470～500nm,光照強(qiáng)度(2000±500)LUX的藍(lán)光照射人RPE細(xì)胞12小時,對RPE細(xì)胞的影響主要是細(xì)胞凋亡,藍(lán)光照射可以成功建立RPE細(xì)胞光損傷模型。
　　 4涼血化瘀方對藍(lán)光誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞凋亡的

9、影響:用Annexin V FITC/PI雙染,流式細(xì)胞儀檢測不同濃度涼血化瘀方中藥粗提物及不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清對藍(lán)光誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞凋亡的影響。中藥粗提物部分實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示:在2mg/ml、200ug/ml、20ug/ml、2ug/ml的濃度范圍內(nèi)對藍(lán)光誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用,凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于光損傷組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且優(yōu)于陽性對照藥組(維生素C組)。含藥血清部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:高、中、低劑

10、量含藥血清的40％、20％、1096、5％濃度組均對藍(lán)光誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。其中濃度為40％、20％高劑量含藥血清組及濃度為40％、20％、10％中劑量含藥血清組和濃度為40％、20％低劑量含藥血清組,對藍(lán)光誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用優(yōu)于陽性對照組,凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于陽性對照組,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；濃度為10％、5％高劑量含藥血清組對藍(lán)光誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用優(yōu)于陽性對照組,凋亡細(xì)胞數(shù)量

11、明顯少于陽性對照組,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；濃度5％的中劑量組及濃度為10％和5％低劑量組與陽性對照組比較細(xì)胞凋亡數(shù)量無明顯差異(P>0.05)。涼血化瘀方對藍(lán)光誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用在一定濃度范圍內(nèi)與藥物濃度高低呈正比。在本實(shí)驗(yàn)研究的濃度范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加保護(hù)作用越明顯。
　　 5涼血化瘀方對人RPE細(xì)胞吞噬作用的影響:中藥粗提物部分實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示:濃度為2mg/ml,200ug/ml組,人RPE細(xì)胞

12、平均吞噬ROS的熒光面積明顯大于未干預(yù)組(P<0.01)即其吞噬ROS數(shù)量多于未干預(yù)組；20ug/ml組,2ug/ml組相對于未干預(yù)組吞噬ROS熒光面積未見明顯差異(P>0.05)。含藥血清部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:高、中、低劑量含藥血清濃度為40％的三個藥物干預(yù)組的人RPE細(xì)胞平均吞噬ROS的熒光面積明顯大于未干預(yù)組(P<0.01)即其吞噬ROS數(shù)量多于未干預(yù)組；余各組相對于未干預(yù)組人RPE細(xì)胞平均吞噬ROS的熒光面積未見明顯差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果

13、表明涼血化瘀方在較高的濃度范圍內(nèi)對人RPE細(xì)胞的吞噬功能有一定的促進(jìn)作用。
　　 結(jié)論：
　　 1胰酶消化法是成功的體外純化培養(yǎng)人RPE細(xì)胞的有效方法,為建立RPE細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
　　 2涼血化瘀方在本實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)對藍(lán)光誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用。
　　 3涼血化瘀方在本實(shí)驗(yàn)的涉及的較高的濃度內(nèi)有提高人RPE細(xì)胞的吞噬功能的作用。
　　 4涼血化瘀方對藍(lán)