芥子氣“脂庫(kù)”蓄積的發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證與親脂型清除劑的篩選和評(píng)價(jià).pdf

1、芥子氣（Sulfur Mustard，簡(jiǎn)稱SM，美軍代號(hào)HD），是一種強(qiáng)效的糜爛性化學(xué)毒劑（也稱起皰劑），號(hào)稱“毒劑之王”，暴露后可造成眼睛、皮膚、肺臟等多組織臟器及粘膜損傷，且病程長(zhǎng)難治愈。由于芥子氣具有制備工藝簡(jiǎn)單、戰(zhàn)斗減員能力強(qiáng)，極難治愈等特點(diǎn)，在戰(zhàn)爭(zhēng)中被多次使用。就我國(guó)而言，芥子氣依然存在巨大的恐怖威脅；芥子氣是日本遺棄化學(xué)武器的主要構(gòu)成部分，特別是在東北地區(qū)，遺棄化學(xué)武器問(wèn)題時(shí)有出現(xiàn)，例如2003年在齊齊哈爾就發(fā)生了日軍遺留芥

2、子氣傷人事件。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外反恐形勢(shì)日趨嚴(yán)峻，我國(guó)周邊安全環(huán)境復(fù)雜，芥子氣被用于恐怖襲擊的可能性日益增加。
　　芥子氣作為廣泛的烷基化毒劑，可引起體內(nèi)多靶點(diǎn)多臟器的中毒損傷，其毒理作用機(jī)制復(fù)雜，常規(guī)的毒理學(xué)研究無(wú)法完全解釋其體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過(guò)程以及物料平衡問(wèn)題，其毒理學(xué)機(jī)制迄今為止仍未完全闡明，且尚無(wú)特效抗毒劑問(wèn)世，因此臨床上僅能采取洗消和改善癥狀為主的綜合治療措施。而目前應(yīng)用的醫(yī)學(xué)干預(yù)措施，則簡(jiǎn)單的將芥子氣中毒損傷視為燒傷進(jìn)行治療

3、，存在早期易誤診、皮膚損傷診斷滯后、皮膚雖經(jīng)清創(chuàng)洗消后仍易反復(fù)糜爛潰爛、器官損傷無(wú)早期診斷指標(biāo)、無(wú)特效解毒藥等重要局限性。
　　本論文采用“化學(xué)轉(zhuǎn)化”策略，打破了芥子氣等具有高反應(yīng)活性化合物準(zhǔn)確定量分析難的瓶頸，同時(shí)結(jié)合同位素稀釋的LC-MS/MS技術(shù)，對(duì)芥子氣暴露后動(dòng)物體內(nèi)芥子氣原型及其氧化產(chǎn)物的含量、組織分布及代謝行為特點(diǎn)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了芥子氣原型“脂庫(kù)”蓄積的現(xiàn)象?；诮孀託庠图捌溲趸a(chǎn)物的分布特點(diǎn)，設(shè)計(jì)具有親脂性的

4、芥子氣清除化合物，以芥子氣及其氧化產(chǎn)物的含量變化和動(dòng)力學(xué)參數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出適合體內(nèi)芥子氣清除的化合物，為芥子氣暴露的醫(yī)學(xué)干預(yù)新措施的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。本文共分為四章。
　　第一章為前言，簡(jiǎn)要介紹了近年來(lái)芥子氣相關(guān)研究進(jìn)展，主要闡述了近年來(lái)芥子氣暴露后的毒理?yè)p傷機(jī)制研究方面的進(jìn)展，針對(duì)芥子氣暴露的治療藥物研究現(xiàn)狀，目前芥子氣原型及其氧化產(chǎn)物的檢測(cè)手段，最后介紹了脂肪組織在芥子氣蓄積方面可能發(fā)揮的作用。并提出本論文的研究意義

5、、研究?jī)?nèi)容和創(chuàng)新點(diǎn)。
　　第二章建立了不同生物基質(zhì)中芥子氣原型及其氧化產(chǎn)物的LC-MS/MS方法，完成了方法學(xué)驗(yàn)證，并對(duì)生物基質(zhì)中芥子氣及其氧化產(chǎn)物同時(shí)定量方法的前處理步驟進(jìn)行了優(yōu)化；采用通過(guò)方法驗(yàn)證的檢測(cè)方法對(duì)芥子氣皮膚染毒大鼠體內(nèi)芥子氣原型及其氧化產(chǎn)物的含量進(jìn)行測(cè)定。目前芥子氣原型的檢測(cè)方法多采用經(jīng)典的氣相色譜法或同位素示蹤法等，但由于其具有較高的反應(yīng)活性，在樣品前處理以及儀器檢測(cè)過(guò)程中不斷進(jìn)行反應(yīng)難以對(duì)生物樣品中芥子氣原型及

6、其氧化產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量，從而無(wú)法準(zhǔn)確進(jìn)行其在體內(nèi)的代謝行為研究。本論文基于同位素稀釋的 LC-MS/MS技術(shù)，利用化學(xué)轉(zhuǎn)化的方式，將芥子氣衍生化為穩(wěn)定的且兼具良好色譜和質(zhì)譜行為的衍生化產(chǎn)物，對(duì)復(fù)雜生物基質(zhì)中芥子氣原型的含量進(jìn)行定量檢測(cè)，該方法前處理簡(jiǎn)單、樣品通量大、回收率高、精密度和準(zhǔn)確度良好，可有效溯源分析生物基質(zhì)中的芥子氣原型。本論文還通過(guò)對(duì)芥子氣及其氧化產(chǎn)物同時(shí)定量分析的方法進(jìn)行了優(yōu)化，增加了固相萃取前處理步驟，降低了生物樣品基質(zhì)

7、效應(yīng)干擾，使得方法能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)大鼠臟器組織中芥子砜的含量。
　　通過(guò)建立芥子氣大鼠皮膚染毒模型，對(duì)芥子氣皮膚染毒后大鼠全血、脂肪及部分組織臟器中芥子氣及其氧化產(chǎn)物含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示芥子氣透皮進(jìn)入體內(nèi)后，大鼠全血中芥子氣原型可5 min即可檢出，0.5-1 h達(dá)峰，而后迅速降低，但血液中芥子亞砜及芥子砜的含量則在3h達(dá)峰，明顯滯后于芥子氣，表明芥子氣經(jīng)透皮進(jìn)入體內(nèi)后，存在由芥子氣逐步氧化代謝生成芥子亞砜及芥子砜的過(guò)程。通過(guò)對(duì)

8、芥子氣原型及其氧化產(chǎn)物在體內(nèi)的組織分布研究結(jié)果表明，脂肪組織中芥子氣原型含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它臟器組織，其含量在1-3h達(dá)到峰值，而后逐漸降低，其含量水平存在一定的量效和時(shí)效關(guān)系，出現(xiàn)了芥子氣原型“脂庫(kù)”蓄積的行為，并且大大延長(zhǎng)了體內(nèi)芥子氣原型的檢測(cè)時(shí)間窗；而脂肪中芥子亞砜及芥子砜的含量較低，遠(yuǎn)低于其它臟器組織中氧化產(chǎn)物的含量，表明脂肪組織為相對(duì)惰性環(huán)境，相對(duì)抑制了芥子氣的強(qiáng)烷基化反應(yīng)活性，減緩其氧化代謝速率。盡管臟器組織中芥子氣原型含量很低

9、，但腎臟中存在較高的芥子亞砜含量，肝臟及脾臟中存在較高含量的芥子砜，并隨時(shí)間延長(zhǎng)，肝臟及脾臟中芥子氣原型和芥子亞砜含量處于逐漸降低的過(guò)程，而芥子砜含量卻呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，直至染毒后6h達(dá)到峰值，提示芥子氣的氧化代謝的過(guò)程可能發(fā)生在肝臟中，并可能由CYP450氧化酶系參與。
　　第三章結(jié)合芥子氣原型脂庫(kù)蓄積的特點(diǎn)，有針對(duì)性的設(shè)計(jì)親脂型清除劑，并利用已建立檢測(cè)方法，以芥子氣皮膚暴露后大鼠體內(nèi)芥子氣、芥子亞砜和芥子砜的含量及動(dòng)力學(xué)參數(shù)為

10、評(píng)價(jià)指標(biāo)，定量評(píng)價(jià)親脂型清除劑的清除效果。結(jié)果顯示，芥子氣皮膚染毒SD大鼠于染毒部位涂抹RSDL后，可有效降低血液及脂肪中芥子氣原型及其氧化產(chǎn)物的含量，并且降低芥子氣原型及其氧化產(chǎn)物的達(dá)峰時(shí)間、消除半衰期和平均駐留時(shí)間；而非染毒部位涂抹RSDL后，其血液及脂肪中芥子氣原型的含量并沒有得到降低，但血液和脂肪中芥子亞砜及芥子砜的含量與芥子氣染毒不給藥組相比有所下降，并且兩種氧化產(chǎn)物在血液和脂肪中的達(dá)峰時(shí)間、消除半衰期和平均駐留時(shí)間均有降低；

11、從結(jié)果可以看出RSDL原部位給藥效果明顯，非染毒部位給藥效果有限，提示RSDL體外清除要遠(yuǎn)優(yōu)于體內(nèi)清除。通過(guò)對(duì)N-乙酰半胱氨酸脂溶性衍生物的原位給藥實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)化合物可以起到降低大鼠血液中芥子氣原型及其氧化產(chǎn)物的作用，但少數(shù)化合物效果相反，會(huì)提高血液中三種被測(cè)物含量。比較芥子氣皮膚染毒尾靜脈給藥硫代硫酸鈉溶液和谷胱甘肽異丙酯后血液中芥子氣原型及其氧化產(chǎn)物動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)的親脂性化合物谷胱甘肽異丙酯降低血液中芥子氣和芥子砜含量的作用

12、明顯好于硫代硫酸鈉。
　　綜合研究結(jié)果表明：基于芥子氣及其氧化產(chǎn)物含量定量檢測(cè)的方法，可以準(zhǔn)確定量描述體內(nèi)三種化合物含量變化，并能夠作為評(píng)價(jià)清除效果的指標(biāo)；RSDL原位涂抹給藥效果明顯并好于非染毒部位給藥，N-乙酰半胱氨酸脂溶性衍生物皮膚涂抹給藥具有清除血液中芥子氣原型及其氧化產(chǎn)物的作用，靜脈注射谷胱甘肽異丙酯的清除效果好于硫代硫酸鈉溶液。揭示出親脂型化合物在芥子氣及其氧化產(chǎn)物的清除或治療方面的優(yōu)勢(shì)，且肯定了定量評(píng)價(jià)藥物效果的可行