路易體癡呆相關(guān)蛋白β-synuclein在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)及對(duì)神經(jīng)元的影響.pdf

1、星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocytes，As）是最大的一類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在帕金森?。≒arkinson's Disease, PD）中的作用日益倍增。在PD中，不僅有黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的大量丟失，還伴有星形膠質(zhì)細(xì)胞的顯著活化與增生。β-突觸核蛋白（β-synuclein，β-syn）突變體V70M和P123H在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)聚集誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加速神經(jīng)退化。但是β-syn突變體V70M和P123H在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)對(duì)神經(jīng)元退化的影響以及

2、介導(dǎo)PD病理學(xué)過(guò)程的機(jī)制還不清楚。本課題將在穩(wěn)定表達(dá)β-syn V70M和P123H的U251細(xì)胞上進(jìn)行，研究β-syn突變體在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)及對(duì)神經(jīng)元的影響，探討星形膠質(zhì)細(xì)胞源性的β-syn突變體在PD病理進(jìn)程中的分子機(jī)制。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴把構(gòu)建好的β-syn野生型和兩種突變型的質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)U251細(xì)胞中，應(yīng)用Western blot方法和免疫熒光標(biāo)記法，鑒定其能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。WST-1和LDH實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染

3、β-syn V70M和P123H的As的存活率顯著下降，細(xì)胞毒性增加。⑵通過(guò)構(gòu)建帶有Flag標(biāo)簽的β-syn野生型和突變型U251星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，我們通過(guò)細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記法和Western blot的方法，探討了β-syn突變體在U251的表達(dá)對(duì)As的影響。把正常的和轉(zhuǎn)染VECT的U251作為對(duì)照組，我們發(fā)現(xiàn)β-syn的WT在胞內(nèi)呈彌散分布的狀態(tài)，β-syn突變體V70M和P123H在U251細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)有聚集體，并且促進(jìn)

4、了U251細(xì)胞內(nèi)α-syn的聚集，一定程度增加GFAP和S100β的表達(dá)，改變了U251細(xì)胞內(nèi)周期與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。⑶收集β-syn野生型和突變型V70M、P123H的U251穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的條件性培養(yǎng)液，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)As內(nèi)的β-syn是否能夠被釋放到細(xì)胞外。結(jié)果表明，U251細(xì)胞內(nèi)不論是野生型還是突變型的β-syn均能夠被釋放到胞外。將收集的β-syn野生型和突變型V70M、P123H的U251穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的條件性培

5、養(yǎng)液，培養(yǎng)SH-SY5Y，通過(guò)應(yīng)用WST-1細(xì)胞活性檢測(cè)法、細(xì)胞免疫熒光法、蛋白免疫印跡法和TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡法，觀察突變的β-syn在As中的表達(dá)對(duì)神經(jīng)元的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，穩(wěn)定表達(dá)β-syn V70M和P123H的U251細(xì)胞條件性培養(yǎng)液，顯著降低了SH-SY5Y的細(xì)胞存活率，增加了α-syn的表達(dá)，促進(jìn)caspase3和p53凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡率上升，并減短了軸突長(zhǎng)度。⑷將帶有Flag標(biāo)簽的β-syn野生型和

6、突變型V70M、P123H的U251穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞和SH-SY5Y直接混合共培養(yǎng)，研究星形膠質(zhì)源性的β-syn能否轉(zhuǎn)移至神經(jīng)元內(nèi)。免疫熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)源性的β-syn能夠被神經(jīng)元細(xì)胞攝取到細(xì)胞內(nèi)。⑸通過(guò)同源重組，采用Cre和Loxp系統(tǒng)，構(gòu)建星形膠質(zhì)細(xì)胞特異敲進(jìn)β-syn V70M基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)過(guò)體重、步距、懸尾等一系列的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠的行為學(xué)發(fā)生異常變化，并伴有抑郁焦慮癥狀的產(chǎn)生。Western blot方法檢測(cè)