山東省部分地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的分離鑒定及其抗體間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosis complex，簡(jiǎn)稱(chēng)結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核菌）引起的一種人畜共患慢性傳染病。人與動(dòng)物結(jié)核病的交叉?zhèn)鞑ピ斐闪私Y(jié)核病的廣泛流行。該病的流行對(duì)人類(lèi)的健康構(gòu)成了威脅，引起各國(guó)人們的廣泛關(guān)注。為控制和消滅此病，必須快速、準(zhǔn)確地做出診斷。經(jīng)幾十年的研究，結(jié)核病診斷技術(shù)從起初的結(jié)核分枝桿菌分離鑒定到血清學(xué)檢測(cè)，再到分子生物學(xué)技術(shù)，已逐漸向著更敏感、更特異、更方便、更經(jīng)濟(jì)的

2、方向發(fā)展。由于結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)、免疫抑制劑的應(yīng)用，還有各地區(qū)結(jié)核病的流行狀況不同，給結(jié)核病的診斷帶來(lái)了很大的難題。所以有必要針對(duì)病人的痰液、血清進(jìn)行結(jié)核菌的分離培養(yǎng)，并結(jié)合PCR技術(shù)等進(jìn)行鑒定，同時(shí)利用重組的結(jié)核分枝桿菌外膜蛋白(OMPA)研制出一種快速、高敏感性ELISA診斷方法，進(jìn)行綜合檢測(cè)。因此，目前建立快速檢測(cè)結(jié)核病的診斷方法尤為重要。
　　 本課題運(yùn)用多種檢測(cè)方法對(duì)山東地區(qū)疑似結(jié)核病人的痰液進(jìn)行結(jié)核菌的分離培

3、養(yǎng)鑒定，對(duì)血清進(jìn)行結(jié)核抗體的檢測(cè)。主要內(nèi)容包括:
　　 1.對(duì)山東部分地區(qū)醫(yī)院結(jié)核病人的痰液進(jìn)行抗酸染色鏡檢和分離培養(yǎng)。根據(jù)各地區(qū)結(jié)核病的爆發(fā)情況和患病嚴(yán)重情況，每個(gè)月進(jìn)行臨床樣本的收集。結(jié)合臨床表現(xiàn)、CT、影像特點(diǎn)、纖維支氣管鏡、胸透等診斷方法對(duì)痰液進(jìn)行初步篩選。共收集256份痰液，進(jìn)行分離培養(yǎng)，培養(yǎng)10-45天，觀察培養(yǎng)結(jié)果。通過(guò)培養(yǎng)和抗酸染色鏡檢，有68份呈陽(yáng)性（鏡檢可疑的作為陽(yáng)性菌），188份呈陰性，陽(yáng)性率為26.56％

4、。根據(jù)結(jié)核菌的生長(zhǎng)情況，對(duì)獲得的菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　 2.利用PCR檢測(cè)方法，成功地對(duì)分離培養(yǎng)的菌株進(jìn)行了鑒定。參考已有的文獻(xiàn)，對(duì)68株菌株提取DNA并用7對(duì)引物進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示:3株為非分枝桿菌;12株為非結(jié)核分枝桿菌(MOTT);40株為結(jié)核菌分枝桿菌(MTBC)或非洲分枝桿菌Ⅱ型;5株為牛型分枝桿菌;3株為卡介苗;2株為田鼠分枝桿菌;3株為非洲分枝桿菌Ⅰ型;未獲得M.caprae分枝桿菌和M.canettii分枝桿菌

5、。其中人感染牛分枝桿菌的比例相對(duì)較高，占所有分離菌株的7.4％。本研究檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，對(duì)臨床診治具有重要意義。
　　 3.以重組蛋白(OMPA)為包被抗原，建立了檢測(cè)TB抗體的間接ELISA方法。對(duì)OMPA-ELISA工作條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳抗原包被液為CB;最佳抗原包被條件為4℃;最佳封閉液濃度為1％ BSA-PBST;最佳抗原包被量為12μg/mL;血清最佳稀釋度為1∶200;最佳血清作用時(shí)間為40min;最佳二

6、抗的稀釋度為1∶5000;最佳二抗作用時(shí)間為40min;底物最佳顯色時(shí)間為15 min;終止后顯色時(shí)間為5min。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示變異系數(shù)均小于10％;特異性試驗(yàn)表明與布氏桿菌病、乙肝、艾滋病等血清之間無(wú)交叉性;保存期試驗(yàn)結(jié)果為4℃可以保存一年。與臨床診斷和結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD)相比，所建立的OMPA-ELISA診斷敏感性、診斷特異性以及準(zhǔn)確率分別為98.15％、95.45％和96.30％。利用上述方法，對(duì)山東部分地區(qū)263份疑似結(jié)核