通過調(diào)控Smad3誘導(dǎo)自噬減輕膿毒癥肺損傷作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　膿毒癥是臨床最常見的嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷以及大手術(shù)后之的并發(fā)癥，短時間內(nèi)可發(fā)展成為多器官功能障礙綜合征，是當(dāng)前創(chuàng)傷、燒傷和外科危重病人死亡的最主要原因。其中膿毒癥相關(guān)急性肺損傷不但出現(xiàn)最早、發(fā)生率最高，而且進(jìn)展迅速，病死率可高達(dá)70％～90％，目前并無有效治療手段。
　　我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)膿毒癥背景下Smad3可以降低重要臟器對LPS的敏感性。同時研究發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad信號通路與自噬密切相關(guān)，而自噬是廣泛存

2、在于真核細(xì)胞的生命現(xiàn)象，具有吞噬病原體、調(diào)解炎癥反應(yīng)、減輕細(xì)胞凋亡等作用。因此我們認(rèn)為Smad3對膿毒癥的保護(hù)機(jī)制和自噬反應(yīng)密切相關(guān)。
　　另外，Smad3的表達(dá)與活化還能夠受到轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)，這一類的調(diào)節(jié)因素主要是由非編碼RNA包括microRNA介導(dǎo)的，而外泌體作為人體內(nèi)一類重要囊泡，其中包含的主要是非編碼RNA（miroRNA，LncRNA等）。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞會通過分泌外泌體囊泡將信號分子傳遞到較遠(yuǎn)的組織或細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控作用

3、。但是在膿毒癥的微環(huán)境中，肺組織細(xì)胞釋放的外泌體中是否包含影響Smad3表達(dá)與活化的microRNAs，并且進(jìn)一步影響到膿毒癥患者預(yù)后的研究，目前尚未見報道。
　　鑒于Smad3在膿毒癥中發(fā)揮保護(hù)作用，利用現(xiàn)有藥物樣本庫篩選針對Smad3本身活化的臨床藥物亦是防治膿毒癥的策略之一。在未獲得Smad3擬效劑的情況下，以膿毒癥致病機(jī)制的關(guān)鍵信號通路——LPS-TLR4通路著手展開針對膿毒癥防治的研究。
　　綜上所述，我們利用Sm

4、ad3基因缺陷小鼠探討Smad3在膿毒癥肺損傷中和自噬的關(guān)系，同時通過利用臨床膿毒癥患者血清標(biāo)本，查找靶向調(diào)控Smad3的外泌體miRNAs，最后通過篩選通路抑制劑藥物來綜合探討膿毒癥防治新策略。
　　第一部分 Smad3調(diào)控自噬減輕膿毒癥肺損傷的作用研究
　　研究目的:通過建立體內(nèi)外Smad3(-/-)小鼠膿毒癥肺損傷模型，觀察smad3敲除后自噬相關(guān)基因表達(dá)的變化。
　　研究方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過氣道滴入LPS構(gòu)建膿毒

5、癥急性肺損傷模型，體外實(shí)驗(yàn)通過慢病毒包裝構(gòu)建穩(wěn)定干擾Smad3的BEAS-2B細(xì)胞系，然后LPS刺激建立體外模型，通過電鏡、HE染色、免疫組化以及ELISA，qPCR、蛋白免疫印跡法等分子生物學(xué)方法觀察炎癥損傷情況以及檢測自噬相關(guān)基因的表達(dá)變化。
　　研究結(jié)果:1.Smad3基因敲除后小鼠膿毒癥肺損傷加重，肺干濕重比增加（*p＜0.05）;HE染色KO組肺泡塌陷更多，出血明顯，中性粒細(xì)胞浸潤較WT組更多;ELISA檢測小鼠血清和肺

6、泡盥洗液TNF-a和IL-6的表達(dá)明顯高于WT對照組(*p＜0.05)。
　　2.損傷早期(6h)電鏡下KO組自噬小體形成明顯增加，但自噬蛋白LC3 mRNA水平表達(dá)下降（*p＜0.05），蛋白水平卻表達(dá)增加;
　　3.成功構(gòu)建si-Smad3 BEAS-2B細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)6h時自噬蛋白LC3B LPS-shSmad3組較LPS-NC組表達(dá)明顯上調(diào)。
　　結(jié)論:Smad3敲除后小鼠膿毒癥肺損傷加重，自噬增加。Smad3可

7、能通過調(diào)控自噬來降低肺對LPS的易感性。
　　第二部分外泌體miRNAs調(diào)控Smad3減輕膿毒癥肺損傷
　　研究目的:利用小RNA高通量測序和基因芯片技術(shù)檢測動物和患者血清外泌體，篩選出靶向調(diào)控Smad3的miRNAs，并驗(yàn)證其調(diào)控自噬的機(jī)制。
　　研究方法:以Smad3（-/-）小鼠構(gòu)建氣道滴入LPS膿毒癥急性肺損傷模型，收集小鼠肺組織一部分通過WB檢測Smad3活化情況，一部分進(jìn)行高通量測序，提取血清和肺泡盥洗液外

8、泌體進(jìn)行基因芯片檢測，再結(jié)合臨床膿毒癥患者不同時期的血清外泌體進(jìn)行小RNA高通量測序，通過組間差異分析以及聚類分析等生物信息學(xué)手段篩選受Smad3調(diào)控的下游miRNAs和靶向調(diào)控Smad3的上游miRNAs，最后用BEAS-2B細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證目的miRNA是否調(diào)控自噬。
　　研究結(jié)果:1.膿毒癥小鼠急性肺損傷6h之后，Smad3磷酸化表達(dá)顯著升高。
　　2.肺組織測序發(fā)現(xiàn)Smad3敲除之后，miR-574-5p表達(dá)減

9、少，而血清和肺泡盥洗液外泌體基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)KO/WT表達(dá)增高的有miR-1196-5p，miR-574-5p，但miR-1196在肺組織測序中沒有檢測到。
　　3.在LPS刺激下，miR-574-5p模擬物外源性刺激BEAS-2B細(xì)胞系，自噬表達(dá)上調(diào);而用miR-574-5p抑制劑可以抑制自噬的表達(dá)。
　　4.膿毒癥患者血清外泌體小RNA測序后組間差異分析發(fā)現(xiàn)對照組和燒傷后10天患者的血清外泌體miRNA相比，有顯著差異p

10、＜0.01的共有69個;和燒傷后20天的患者血清外泌體miRNA比較，兩組有顯著差異p＜0.01的共有74個;和燒傷后30天組相比，兩組有顯著差異p＜0.01的共有42個。
　　5.時間序列分析篩選出差異表達(dá)下降的miRNAs，再進(jìn)行靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)和 smad3，LC3B同時相關(guān)的一共有5個，分別是miR-9-5p,miR-3135b,miR-432-5p,miR-409-3p,miR-744-5p。經(jīng)體外細(xì)胞系RAW264.7膿

11、毒癥模型驗(yàn)證其表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)變化趨勢和臨床膿毒癥患者血清基本一致。
　　結(jié)論:1.小鼠膿毒癥肺損傷早期Smad3缺失導(dǎo)致自噬上調(diào)，其機(jī)制可能與肺上皮細(xì)胞分泌miR-574誘導(dǎo)自噬發(fā)生有關(guān)。
　　2.smad3基因在臨床膿毒癥患者中發(fā)揮的保護(hù)作用可能與上游靶向調(diào)控它，的miRNAs下降有關(guān)。
　　第三部分 LPS-TLR4信號通路抑制劑DMF防治膿毒癥機(jī)制
　　研究目的:分子層面探索DMF抑制LPS-TLR4信號活化

12、的機(jī)制并驗(yàn)證其對膿毒癥的防治作用。
　　研究方法:從臨床藥物庫篩選LPS-TLR4通路抑制劑DMF，利用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞，設(shè)不同的DMF濃度梯度組，采用免疫蛋白印跡檢測NFkB信號通路中4個關(guān)鍵蛋白的活化情況。最后以LPS腹腔注射構(gòu)建膿毒癥模型，通過動物生存率實(shí)驗(yàn)觀察其對膿毒癥的防治效果。
　　研究結(jié)果:1.RAW細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后DMF干預(yù)組，NO濃度依次降低，iNOS表達(dá)受到抑制;同時DMF抑制LPS-TL

13、R4通路下游IKK，IkB，NFkB磷酸化表達(dá)，而IRAK蛋白表達(dá)沒有變化。
　　2.生存率時間效應(yīng)梯度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有術(shù)前給藥36h和48h能達(dá)到50％的生存率，（*p＜0.05），生存率劑量效應(yīng)梯度實(shí)驗(yàn)證實(shí)DMF30mg/Kg可以提高小鼠膿毒癥生存率50％，15mg/Kg可以提升25％（*p＜0.05）。
　　3.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明DMF可以有效抑制炎癥因子TNF-a，IL-6，IL-10的表達(dá)（*P＜0.05），另外HE染色顯