抗鞘翅目Bt殺蟲基因GFM cry3Bb的人工合成、原核表達及植物轉(zhuǎn)基因的研究.pdf

1、鞘翅目通稱甲蟲,全世界已知約33萬種,中國已知約7000種.鞘翅目是昆蟲綱中乃至動物界種類最多、分布最廣的第一大目.鞘翅目昆蟲是近年來危害越來越嚴重的植物害蟲,字身披鞘殼,繁殖速度快,化學(xué)殺蟲劑防治難度較大.常規(guī)育種由于受到種質(zhì)資源稀少的限制,目前還未很好解決抗鞘翅目害蟲的育種問題.利用基因工程技術(shù)把具有殺鞘翅目活性的Bt殺蟲晶體蛋白基因轉(zhuǎn)入植物,培育抗鞘翅目新品種是控制其危害的一條新途徑.大量的研究表明,將野生型Bt基因直接轉(zhuǎn)入到植物

2、中,表達量很低甚至不表達,而不具有抗蟲的實際效果.該研究有目的地利用植物的偏好密碼子對原始Bt基因密碼子進行優(yōu)化,調(diào)整并去除會影響mRNA穩(wěn)定的序列元件,以期獲得高抗鞘翅目并適合于在植物中高效表達的新基因,為培育抗鞘翅目昆蟲的作物品種打下基礎(chǔ).其主要工作結(jié)果如下:1.設(shè)計并人工合成Bt GFMcry3Bb殺蟲基因.在保證野生型基因氨基酸序列不變的前提下,用植物的偏好密碼子對核苷酸序列進行優(yōu)化,去掉了原有基因的44處PPSS信號序列和4處

3、ATTTA序列,AT富集區(qū)(≥5個A/T)也由野生型的47處減少到改造后的4處.使G+C含量由原來的32.96﹪提高到49.43﹪,達到了植物基因的GC含量水平.改造后的基因與天然的cry3Bb基因保持了74﹪的核苷酸序列同源性,總共修改了725個密碼子中的477個,改變幅度達到65.8﹪.用連續(xù)延伸PCR法擴增出了全長的基因,克隆到通用載體pBluescript Ⅱ SK上,測序結(jié)果和預(yù)期設(shè)計的序列完全一致.2.構(gòu)建了該殺蟲基因的原核

4、表達載體pGEX-GFMcry3Bb,在E.coli中獲得了高效表達的融合蛋白,并利用親和層析的方法成功地對其進行了純化,純化的蛋白大小與預(yù)期一致.3.利用純化的cry3Bb蛋白進行兔免疫,得到相應(yīng)的多克隆抗體,經(jīng)間接ELISA法檢測其效價為1:8000,可以用于轉(zhuǎn)基因植物的ELISA法檢測.4.構(gòu)建了人工合成的GFMcry3Bb基因的雙子葉植物表達載體pGeneral-GFMcry3Bb.5.通過轉(zhuǎn)化,獲得了轉(zhuǎn)GFMcry3Bb基因的