甘草酸通過調(diào)節(jié)CX3CL1-CX3CR1通路緩解異氟烷致發(fā)育期大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙.pdf

1、第一部分甘草酸緩解異氟烷所致發(fā)育期大鼠認(rèn)知功能障礙
　　目的：探討甘草酸能否通過作用于發(fā)育期大鼠海馬HMGB1緩解異氟烷暴露所致發(fā)育期大鼠認(rèn)知功能改變。
　　方法：出生后7天（PND7）的大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（CON）、異氟烷組（ISO）、甘草酸組（Gly）及異氟烷+甘草酸組（ISO+Gly）。CON組和Gly組分別經(jīng)腹腔注射生理鹽水或甘草酸溶液30分鐘后接受對(duì)照氣體處理4小時(shí)，ISO組和ISO+Gly組分別經(jīng)腹腔注射生理鹽

2、水和甘草酸溶液30分鐘后接受1.8％異氟烷處理4小時(shí)。麻醉結(jié)束后對(duì)四組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物立即行左心室采血進(jìn)行血?dú)夥治觯鹘M大鼠每組隨機(jī)選取5只于麻醉結(jié)束后0、6、12和48小時(shí)分離及取出海馬組織。采用蛋白印跡雜交（Western blot）技術(shù)，檢測(cè)異氟烷暴露及甘草酸作用對(duì)發(fā)育期大鼠海馬中HMGB1蛋白表達(dá)的影響，其余各組大鼠在麻醉結(jié)束后24天（PND31）接受水迷宮訓(xùn)練并進(jìn)行測(cè)試，以評(píng)估異氟烷暴露及甘草酸作用對(duì)發(fā)育期大鼠認(rèn)知功能造成的影響。

3、r>　　結(jié)果：①血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示，pH值、PaCO2、PaO2、血糖值及SaO2均在生理范圍內(nèi)（P>0.05）。②Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，異氟烷組大鼠海馬中HMGB1表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)，并于麻醉結(jié)束后12小時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值（P<0.05）。給予甘草酸后異氟烷暴露導(dǎo)致海馬中HMGB1表達(dá)上調(diào)得到有效抑制（P<0.05）。③Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，異氟烷組大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能異常的表現(xiàn)：逃避潛伏時(shí)間

4、和運(yùn)動(dòng)軌跡延長（P<0.05），平臺(tái)穿越次數(shù)減少（P<0.05），并且上述變化均可被甘草酸作用逆轉(zhuǎn)和減輕（P<0.05）。
　　結(jié)論：異氟烷作用可導(dǎo)致發(fā)育期大鼠海馬HMGB1蛋白表達(dá)量升高。甘草酸作用可緩解異氟烷暴露所致海馬 HMGB1蛋白表達(dá)水平增高并減輕發(fā)育期大鼠的認(rèn)知功能損傷。
　　第二部分甘草酸可緩解海馬炎癥反應(yīng)減輕異氟烷所致發(fā)育期大鼠海馬突觸功能障礙和細(xì)胞凋亡
　　目的：探討甘草酸對(duì)異氟烷暴露誘發(fā)的發(fā)育期大鼠

5、海馬神經(jīng)炎癥反應(yīng)、突觸功能障礙及神經(jīng)元凋亡的影響。
　　方法：將出生后7天（PND7）的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（CON）、異氟烷組（ISO）、甘草酸組（Gly）及異氟烷+甘草酸組（ISO+Gly）。CON組和Gly組大鼠分別在腹腔注射生理鹽水或甘草酸溶液30分鐘后接受對(duì)照氣體處理4小時(shí)，ISO組和ISO+Gly組分別腹腔注射生理鹽水和甘草酸溶液30分鐘后接受1.8%異氟烷處理4小時(shí)。于麻醉結(jié)束后12小時(shí)分離并提取海馬組織蛋白進(jìn)行蛋白印

6、跡雜交（Western blot）檢測(cè)，以比較異氟烷及甘草酸作用前后海馬中Bcl-2、Bax、cleaved(active) caspase-3，突觸功能蛋白PSD-95、SNAP-25和炎癥相關(guān)因子以及NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化；采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)海馬中炎癥因子IL-1β，TNF-α表達(dá)量變化。結(jié)果：①Western Blot結(jié)果顯示，甘草酸作用可減弱異氟烷暴露所致發(fā)育期大鼠海馬cleaved(active

7、) caspase-3和促凋亡蛋白Bax表達(dá)量上調(diào)，并且有效減弱異氟烷暴露所致的海馬中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。此外，甘草酸作用可逆轉(zhuǎn)異氟烷暴露對(duì)海馬PSD-95SNAP-25蛋白表達(dá)量的下調(diào)作用（P<0.05）。②ELISA結(jié)果顯示甘草酸可抑制異氟烷暴露導(dǎo)致的海馬IL-1β，TNF-α表達(dá)上調(diào)。③Western Blot結(jié)果顯示，異氟烷暴露可上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)量（P<0.05），同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)

8、NF-κB及IκBα蛋白表達(dá)量下調(diào)（P<0.05），甘草酸作用后可有效減弱上述變化（P<0.05）。
　　結(jié)論：甘草酸可有效抑制異氟烷暴露所誘發(fā)的發(fā)育期大腦內(nèi)細(xì)胞凋亡并抑制突觸蛋白PSD-95及 SNAP25表達(dá)量下調(diào)，甘草酸還可減弱異氟烷暴露誘發(fā)的發(fā)育期大腦內(nèi)促炎癥因子表達(dá)增加，此外，NF-κB通路可能參與上述變化。
　　第三部分甘草酸通過調(diào)節(jié)CX3CL1/CX3CR1通路緩解異氟烷所致海馬神經(jīng)元凋亡和炎癥反應(yīng)
　　

9、目的：探討甘草酸通過調(diào)節(jié)CX3CL1/CX3CR1信號(hào)通路緩解異氟烷所致發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)元凋亡和炎癥反應(yīng)。
　　方法：①在體實(shí)驗(yàn)：將出生后7天（PND7）的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（CON）、異氟烷組（ISO）及異氟烷+甘草酸組（ISO+Gly）。CON組大鼠在腹腔注射生理鹽水30分鐘后接受對(duì)照氣體處理4小時(shí)，ISO組和ISO+Gly組大鼠分別經(jīng)腹腔注射生理鹽水和不同劑量甘草酸溶液30分鐘后接受1.8%異氟烷處理4小時(shí)。對(duì)照組和異氟烷

10、組大鼠在麻醉結(jié)束后0h,6h,12h和48h分離海馬組織，通過Western blot檢測(cè)海馬中CX3CL1和CX3CR1的蛋白表達(dá)變化，麻醉結(jié)束后12h時(shí)檢測(cè)對(duì)照組（CON）、異氟烷組（ISO）及異氟烷+不同劑量甘草酸組（ISO+Gly）海馬CX3CL1表達(dá)變化。②離體實(shí)驗(yàn)：原代神經(jīng)元體外培養(yǎng)5~7天后，將其隨機(jī)分為5組：（1）對(duì)照組（CON）：接受對(duì)照氣體（空氣）暴露4小時(shí);（2）異氟烷（ISO）組：接受1.8%異氟烷暴露4小時(shí);（

11、3）甘草酸組(Gly）：神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入終濃度為100μM的甘草酸，30分鐘后接受對(duì)照氣體暴露4小時(shí);（4）異氟烷+甘草酸組（ISO+ Gly）：神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入終濃度為100μM的甘草酸溶液，30分鐘后接受1.8%異氟烷暴露4小時(shí)；（5）異氟烷+甘草酸+抗CX3CR1抗體組（ISO+ Gly+anti-CX3CR1）：于神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入終濃度為100μM的甘草酸和1μg/ml anti-CX3CR1抗體，干預(yù)30分鐘后接受1.8

12、%異氟烷暴露4小時(shí)。麻醉結(jié)束后2h取上層培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基中CX3CL1，IL-1β和 TNF-α的表達(dá)水平變化，TUNEL檢測(cè)神經(jīng)元凋亡水平，Western blot檢測(cè)HMGB1及磷酸化Akt的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：①異氟烷麻醉后發(fā)育期大鼠海馬CX3CL1表達(dá)水平逐漸下降，于6小時(shí)后最低，并在之后48小時(shí)內(nèi)逐漸恢復(fù)（P<0.01）。而CX3CR1的表達(dá)并不受到異氟烷麻醉的影響（P>0.05）。②10、20、3

13、0 mg/kg的甘草酸均能顯著緩解異氟烷導(dǎo)致的發(fā)育期大鼠海馬CX3CL1表達(dá)水平下降（P<0.01或P<0.05）。③離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘草酸可緩解異氟烷暴露所致的海馬神經(jīng)元凋亡、CX3CL1釋放減少及 IL-1β、TNF-α釋放增加（P<0.01或P<0.05），而這些作用都能被CX3CR1抗體拮抗（P<0.01）。
　　結(jié)論：甘草酸可能通過調(diào)節(jié)CX3CL1/CX3CR1信號(hào)通路緩解異氟烷暴露所致發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)元凋亡和炎癥反