Akt-mTOR-p70S6K通路在HSC-T6的活化增殖中的作用及梔子苷抗肝纖維化作用研究.pdf

1、肝纖維化(fibrosis of liver)實(shí)質(zhì)是一種由多種原因病毒、代謝、藥物、酒精、血吸蟲等引起的慢性肝損傷的傷口愈合反應(yīng),它的主要表現(xiàn)是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix,ECM)在狄氏間隙(Space of Disse)的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞層大量過度沉積及所導(dǎo)致的肝臟功能的損傷,是慢性肝病發(fā)展到肝硬化必經(jīng)階段。大量實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí),活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是過度沉積的

2、ECM的主要來源,而且HSC的活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的核心環(huán)節(jié),通過抑制HSC活化增殖可以減緩肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　梔子是藥食兩用的傳統(tǒng)中藥,又稱為黃梔子、山梔子,藥用梔子是茜草科植物梔子的成熟果實(shí),具有利膽、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用。梔子苷(geniposide),屬于環(huán)烯醚萜類化合物,是梔子藥效作用的主要有效成分,有研究表明,梔子苷具有利膽、保肝、抗炎等方面作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明,梔子苷具有肝臟保護(hù)作用,進(jìn)一步研究發(fā)

3、現(xiàn),梔子苷能夠抑制PDGF介導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞增殖活化,其具體作用機(jī)制可能與阻斷了Akt/mTOR/p70S6K通路有關(guān)。
　　核糖體70S小亞基S6蛋白激酶(p70S6K)是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mamm--alian target of Rapamycin,mTOR)的下游底物,它是一種核糖體蛋白激酶,可以促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖,研究表明,在癌癥等疾病中,p70S6K活化水平明顯升高,抑制其表達(dá)可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。鑒于

4、p70S6K在細(xì)胞增殖中的重要作用,我們設(shè)想阻斷p70S6K的活性可以抑制HSC的活化增殖。為驗(yàn)證這一設(shè)想,采用Western blot方法檢測了磷酸化p70S6K在肝纖維化大鼠肝組織以及活化的HSC-T6中的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在纖維化組織和活化的HSC-T6中,磷酸化p70S6K的表達(dá)水平都明顯升高,提示,p70S6K有可能參與調(diào)節(jié)HSC的活化增殖,影響肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。為進(jìn)一步闡明p70S6K與HSC活化增殖之間的聯(lián)系,本課題進(jìn)

5、行了以下研究。
　　1.磷酸化p70S6K在肝纖維化大鼠肝組織和活化的肝星狀細(xì)胞系HSC-T6中的蛋白表達(dá)
　　SD大鼠灌胃給予CCl4,建立肝纖維化模型,Western blot檢測磷酸化p70S6K、肝纖維化大鼠肝組織中的蛋白表達(dá);PDGF(10 ng/ml)誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞活化,Western blot檢測磷酸化p70S6K在活化的HSC-T6細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),磷酸化p70S6K在纖維化的肝組織和活化

6、的HSC-T6細(xì)胞中表達(dá)均升高了。
　　2.抑制p70S6K的活性對大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6活化增殖的影響
　　利用雷帕霉素(2,20,50ng/ml)預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞2h后,再加PDGF(10ng/ml)作用24h或48h,運(yùn)用MTT和流式細(xì)胞儀檢測HSC-T6細(xì)胞增殖情況和細(xì)胞周期分布,Western blot和RT-PCR檢測HSC-T6細(xì)胞磷酸化p70S6K、α-SMA和Collagen I的表達(dá)情況;利用

7、LipofectamineTM2000將特異性p70S6K-siRNA轉(zhuǎn)染到HSC-T6內(nèi),下調(diào)p70S6K的表達(dá),降低其活性,運(yùn)用MTT和流式細(xì)胞儀檢測HSC-T6細(xì)胞增殖情況和細(xì)胞周期分布,Western blot和RT-PCR檢測HSC-T6細(xì)胞磷酸化p70S6K、α-SMA和Collagen I的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),雷帕霉素和p70S6K-siRNA作用均降低了p70S6K的活性,抑制了HSC-T6的活化和增殖。
　　

8、3.梔子苷單體對PDGF誘導(dǎo)的HSC-T6活化增殖的影響
　　不同濃度的梔子苷(20,50,100,200,400μg/ml)作用于HSC-T6細(xì)胞,MTT檢測細(xì)胞活力,判斷梔子苷的細(xì)胞毒性;用低、中、高濃度的梔子苷(20,50,100μg/ml)預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞2h后,再加PDGF(10ng/ml)作用24h或48h,運(yùn)用MTT檢測細(xì)胞活力,Western blot檢測HSC-T6細(xì)胞活化增殖MAPK通路蛋白ERK、p38