替拉那韋對乙型肝炎病毒復(fù)制的抑制作用研究.pdf

1、背景：乙型肝炎是人類健康的嚴(yán)重威脅，引起乙肝的病原體是乙型肝炎病毒（HBV）。根據(jù)世界衛(wèi)生組織所進(jìn)行的調(diào)查統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)乙肝的發(fā)病率快速增長，已經(jīng)有超過3億人感染HBV，中國感染HBV的患者數(shù)量眾多，約有1億乙肝患者，且乙肝病毒感染造成的肝臟損傷十分嚴(yán)重，加之乙型肝炎引發(fā)的繼發(fā)疾?。ǜ喂δ芩ソ摺⒏伟┑龋┧劳雎瘦^高，使其成為嚴(yán)重危害人類健康的問題。
　　抗病毒治療是乙型肝炎治療的關(guān)鍵，其主要策略是最大限度地有效抑制HBV增殖，防止

2、病毒進(jìn)一步損傷肝臟細(xì)胞，破壞肝臟的生理代謝功能，減少其引發(fā)更嚴(yán)重的肝臟疾病，從而使乙型肝炎患者的病情得到控制。目前，臨床常用治療乙肝的抗病毒藥物有核苷類似物（拉米夫定、阿得福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等），干擾素（主要是α-干擾素）和免疫調(diào)節(jié)劑（左旋咪唑、糖皮質(zhì)激素、白細(xì)胞介素2、乙肝免疫球蛋白等）。核苷類似物是目前臨床上抗病毒最有效的藥物，其作用機(jī)制是通過抑制病毒的DNA多聚酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的活性達(dá)到抑制病毒復(fù)制的效果，但一旦HBV病毒DN

3、A多聚酶發(fā)生變異就會導(dǎo)致耐藥，且停藥后病情容易反彈和復(fù)發(fā)。而干擾素和免疫調(diào)節(jié)劑有嚴(yán)重的副作用。因此，有必要針對新靶點開發(fā)能有效抑制HBV轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的新型乙肝治療藥物。
　　眾所周知，病毒自身由于沒有實現(xiàn)新陳代謝所必需的基本成分，病毒自身不能復(fù)制。當(dāng)病毒感染宿主細(xì)胞時，會脫去蛋白質(zhì)外套，其核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，借助宿主細(xì)胞的關(guān)鍵分子，按照病毒基因的指令產(chǎn)生新的病毒。通過干預(yù)宿主細(xì)胞的關(guān)鍵分子來抑制病毒的復(fù)制是尋找新型乙肝治療性藥物的重

4、要方向,宿主細(xì)胞關(guān)鍵靶標(biāo)分子的選擇是藥物篩選的前提。SIRT1是近年來病理學(xué)研究的熱點，它作為第Ⅲ類組蛋白去乙?；?，通過去乙酰化修飾的方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)。SIRT1的生理作用十分廣泛，主要參與調(diào)控細(xì)胞的生理周期、細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞內(nèi)的多種代謝反應(yīng)，對細(xì)胞的正常生長及各種生理功能的調(diào)節(jié)起重要作用。
　　SIRT1作為第Ⅲ類組蛋白去乙?；?，也是形成HBV共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的微型染色體的一個結(jié)構(gòu)組件，并且Patri

5、ce André等學(xué)者的研究證實了在SIRT1激活劑作用下，SIRT1與法尼酯X受體（FXR）、過氧化物酶體增殖物活化受體（PPARs）協(xié)同作用可使得乙肝病毒RNA的合成大幅增多，我國學(xué)者黃愛龍等也證實了SIRT1沉默能顯著地抑制HBV復(fù)制中間體、3.5kb的mRNA和核心蛋白的表達(dá)，且SIRT1抑制劑對HBV復(fù)制中間體等有抑制作用。以上研究表明，SIRT1確實參與了乙肝病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，提示SIRT1有望成為乙型病毒性肝炎治療的新靶標(biāo)

6、。
　　然而，以SIRT1為靶標(biāo)的抗HBV藥物還未有相關(guān)報道。替拉那韋是一種已經(jīng)用于臨床的抗病毒藥物，本實驗室的前期研究表明替拉那韋具有SIRT1抑制活性。因而，研究替拉那韋對乙型肝炎病毒的抑制作用很有意義。
　　目的：本項目將不同濃度的替拉那韋作用于轉(zhuǎn)染了乙肝病毒的細(xì)胞，以拉米夫定和sirtinol作為陽性對照，驗證替拉那韋在體外對乙型肝炎病毒復(fù)制的抑制作用，分別驗證替拉那韋在體外對乙型肝炎病毒DNA復(fù)制及三種乙肝抗原（乙

7、肝表面抗原、乙肝e抗原和乙肝核心抗原）表達(dá)的抑制作用。并進(jìn)一步檢測替拉那韋對乙肝病毒復(fù)制相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響，初步探討替拉那韋抑制乙肝病毒復(fù)制的作用機(jī)制。
　　研究內(nèi)容：
　　1.替拉那韋的細(xì)胞毒性研究
　?、衮炞C替拉那韋對肝臟細(xì)胞的毒性，CCK-8法檢測替拉那韋對L02細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、HepAD38細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞的細(xì)胞毒性，計算增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度，比較替拉那韋對不同肝臟細(xì)胞

8、的細(xì)胞毒性作用；
　?、谝訪02細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、HepAD38細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞為靶細(xì)胞，CCK-8法比較替拉那韋與陽性對照藥物:拉米夫定、Sirtinol（SIRT1抑制劑）對這些細(xì)胞的增殖抑制率。
　　2.替拉那韋在DNA水平對乙肝病毒復(fù)制的抑制作用研究
　　驗證替拉那韋對乙型肝炎病毒在體外復(fù)制的影響。以HepAD38細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞為靶細(xì)胞，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢

9、測乙肝病毒DNA在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況。
　　3.替拉那韋在蛋白水平對乙肝病毒的抑制作用研究
　　驗證替拉那韋對乙型肝炎病毒在體外復(fù)制的影響。以HepAD38細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞為靶細(xì)胞，應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測乙肝病毒抗原（乙肝表面抗原、乙肝e抗原和乙肝核心抗原）的表達(dá)情況。
　　4.替拉那韋抑制乙肝病毒復(fù)制的作用機(jī)制的初步研究
　　以HepAD38細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞為靶細(xì)胞，應(yīng)用western

10、 blot技術(shù)檢測替拉那韋對乙肝病毒復(fù)制的關(guān)鍵分子（sirt1、AP1等）表達(dá)的影響。初步探討替拉那韋抑制乙肝病毒復(fù)制的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.通過CCK-8實驗檢測替拉那韋的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明：替拉那韋對轉(zhuǎn)染了HBV的HepAD38細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯大于未轉(zhuǎn)染HBV的L02細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，其中對L02細(xì)胞的細(xì)胞毒性最小。替拉那韋對L02細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞、HepG2

11、細(xì)胞、HepAD38細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關(guān)系。并且替拉那韋對上述細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用比陽性對照藥物（拉米夫定、Sirtinol）對這些細(xì)胞的細(xì)胞毒性強(qiáng)很多。
　　2.運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)，檢測HBV DNA結(jié)果表明：不同濃度的替拉那韋分別作用于HepG2.2.15細(xì)胞和HepAD38細(xì)胞，替拉那韋能顯著抑制HBV DNA的表達(dá)，并呈現(xiàn)濃度依賴性。濃度為2.5μmol/L的替拉那韋對HBV

12、DNA的表達(dá)的抑制效果與濃度為25μmol/L的sirtinol或濃度為20μmol/L的拉米夫定相當(dāng)。
　　3.運(yùn)用ELISA技術(shù)，檢測乙肝病毒三種抗原的表達(dá)，結(jié)果表明：不同濃度的替拉那韋分別作用于HepG2.2.15細(xì)胞和HepAD38細(xì)胞，替拉那韋能顯著抑制HBV三種抗原的表達(dá)，并呈現(xiàn)濃度依賴性。濃度為5μmol/L的替拉那韋對HBV表面抗原的表達(dá)的抑制作用與濃度為25μmol/L的sirtinol或濃度為20μmol/L的

13、拉米夫定相當(dāng);濃度為10μmol/L的替拉那韋對HBV e抗原的表達(dá)的抑制作用接近濃度為25μmol/L的sirtinol或濃度為20μmol/L的拉米夫定;濃度為10μmol/L的替拉那韋對HBV核心抗原的表達(dá)的抑制作用與濃度為25μmol/L的sirtinol或濃度為20μmol/L的拉米夫定相當(dāng)。
　　4.運(yùn)用western blot技術(shù)，檢測替拉那韋對HBV復(fù)制的關(guān)鍵分子:SIRT1、AP1表達(dá)的影響，結(jié)果表明：替拉那韋對