植物抗病毒基因工程研究Ⅰ黃瓜花葉病毒復(fù)制酶基因表達(dá)載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化Ⅱ?qū)氩《净虻霓D(zhuǎn)基因植物釋放的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文植物抗病毒基因工程研究Ⅰ黃瓜花葉病毒復(fù)制酶基因表達(dá)載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化Ⅱ?qū)氩《净虻霓D(zhuǎn)基因植物釋放的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估姓名：溫瑞申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：鄭重周雪平2001.5.1激素比率，芽的分化率(葉盤上形成的芽數(shù)與葉盤的比)可達(dá)500％V冀上。通過葉盤轉(zhuǎn)化法，同樣獲得了轉(zhuǎn)化CMVFny全長的2a復(fù)制酶基因的番茄植株。對(duì)10株轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行PCR檢測(cè)，有7株能夠擴(kuò)增出目的基因。取3株P(guān)CR鑒定為陽性的植株

2、，進(jìn)行Southernblot印跡分析，其雜交結(jié)果均為陽性，而且其中1株存在多拷貝，表明CMVFny2a復(fù)制酶基因已整合于番茄基因組DNA中。對(duì)3株番茄的Northernblot印跡分析發(fā)現(xiàn)2株雜交信號(hào)為陽性，表明轉(zhuǎn)入番茄的CMVFny2a復(fù)制酶基因已在部分受體植物中得到表達(dá)。用CMVP1株系和CMVRB株系接種轉(zhuǎn)基因植物，通過癥狀觀察和ELISA檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因植株有三種不同的抗性反應(yīng)。即癥狀嚴(yán)重型；癥狀延遲型；無癥狀型。ELISA測(cè)定結(jié)

3、果也表明，一部分轉(zhuǎn)基因植物對(duì)CMVP1株系和CMVRB株系沒有抗性；一部分轉(zhuǎn)基因植物具有延遲發(fā)病作用；少部分轉(zhuǎn)基因植物具有抗病作用。有關(guān)抗性機(jī)理的研究正在進(jìn)行中。導(dǎo)入ToMV、TMv移動(dòng)蛋白基因的煙草和導(dǎo)入CMVPI—RP復(fù)制酶基因的煙草，分別經(jīng)組織培養(yǎng)擴(kuò)繁并移栽于溫室中。4—5葉期分別接種CMVRB株系、PVX、PvY、TMV，并以非轉(zhuǎn)化普通煙為對(duì)照。癥狀觀察表明，病毒在轉(zhuǎn)基因植株上的癥狀與對(duì)照植株上的癥狀無明顯差異，ELISA測(cè)定也

4、表明轉(zhuǎn)化植株體內(nèi)病毒的含量與對(duì)照相近。將導(dǎo)入ToMV移動(dòng)蛋白基因的煙草接種TMV，一個(gè)月后取其系統(tǒng)葉接種心葉煙和三生煙(NN基因型)，并以TMV接種心葉煙和三生煙為對(duì)照。癥狀觀察結(jié)果表明兩者接種的心葉煙和三生煙病斑大小相近、病斑顏色相同。隨后10個(gè)月中定期取系統(tǒng)葉接種心葉煙和三生煙，觀察病斑大小的變化，沒有發(fā)現(xiàn)所轉(zhuǎn)基因與接種病毒之間的重組。將導(dǎo)入CMVP1一RP復(fù)制酶基因的煙草接種CMVRB株系，一個(gè)月后取其系統(tǒng)葉接種蠶豆，并以CMVR