褶紋冠蚌過氧化氫酶基因克隆、原核表達及酶活性分析.pdf

1、褶紋冠蚌(Cristaria plicata)是我國重要“淡水育珠蚌”之一,近年來褶紋冠蚌頻繁受到病害的影響,對其育珠能力產(chǎn)生了極大的影響。本文對褶紋冠蚌過氧化氫酶(cpCAT)的cDNA進行了克隆與原核表達。
　　 本文利用RACE-PCR及同源克隆方法,克隆出cpCAT cDNA全長。該基因全長為4863 bp,且有3個外顯子,2個內(nèi)含子。cpCATcDNA全長為2618 bp,其中編碼區(qū)1503 bp,5’端不翻譯區(qū)136

2、 bp,3’端不翻譯區(qū)979 bp,具有典型的腺苷酸信號序列AATAAA和PolyA尾。該基因序列開放閱讀框編碼為501個氨基酸,預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為56.86kDa,等電點為6.77。BLAST分析顯示cpCAT氨基酸序列和動物,植物,細菌的CAT基因有很高的同源性。cpCAT無信號肽,存在過氧化氫酶近端活性位點(61FNRERIPERVVHAKGAG77)和過氧化氫酶近端血紅素配體簽名序列(315RLYSYSDTH359),兩個糖基化

3、位點(145NNTP148)與(436NFSQ439)。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明褶紋冠蚌與櫛孔扇貝(Chlamys farreri)過氧化氫酶基因的親緣關(guān)系最近。
　　 利用RT-PCR分析檢測cpCAT基因經(jīng)注射嗜水氣單胞菌后的表達情況,結(jié)果表明在注射嗜水氣單胞菌后,在血液、鰓、外套膜、閉殼肌和肝臟中都有表達,且在肝臟中的表達量最高,且各個組織中cpCAT基因的表達明顯增加,12h后達到最大值,隨后表達有所下降,到48h后恢復(fù)至原有

4、水平。結(jié)果表明褶紋冠蚌在受到病害后,其體內(nèi)的過氧化氫酶具有防御作用。
　　 根據(jù)開放閱讀框設(shè)計帶酶切位點(KpnI和.EcoRI)的引物,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達,利用SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物。結(jié)果表明重組cpCAT在大腸桿菌(Escherichia coli)Rosetta-gami(DE3)中獲得了表達,產(chǎn)物為56.86 KDa。純化的cpCAT的酶活力可達11194.4±40.4U／mg,該酶最適溫度為25