大草蛉5個(gè)化感蛋白基因的組織表達(dá)譜及配體結(jié)合能力分析.pdf

1、昆蟲(chóng)在漫長(zhǎng)的進(jìn)化中，形成了高度靈敏的嗅覺(jué)感知系統(tǒng)，并以此來(lái)感受環(huán)境中的各種化學(xué)物質(zhì)，從而做出相應(yīng)的生理或行為反應(yīng)，如取食、交配、尋找適宜的產(chǎn)卵地點(diǎn)等。在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)感受過(guò)程中，化學(xué)感受蛋白（Chemosensory protein，CSP）和氣味結(jié)合蛋白（Odorant binding protein，OBP）具有類(lèi)似的功能，即結(jié)合和運(yùn)載氣味分子穿過(guò)感器淋巴液到達(dá)氣味受體(Odorant receptor，OR)。大草蛉Chrysopa p

2、allens(Rambur)，是棉花等多種農(nóng)作物田間的重要捕食性天敵昆蟲(chóng)，其捕食對(duì)象包括蚜蟲(chóng)、葉螨、蚧殼蟲(chóng)和薊馬等，在害蟲(chóng)的生物防治中具有重要作用。研究天敵昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)機(jī)制，對(duì)于篩選高效的天敵引誘物質(zhì)及開(kāi)發(fā)基于嗅覺(jué)調(diào)控的天敵高效利用新策略具有重要意義，但有關(guān)大草蛉嗅覺(jué)基因的研究卻較少。本文采用RT-qPCR、原核表達(dá)、熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)、觸角電位技術(shù)及Y型嗅覺(jué)儀，對(duì)大草蛉的5個(gè)CSP基因進(jìn)行了克隆及功能探討。主要結(jié)果如下:
　　1、大

3、草蛉化學(xué)感受蛋白基因的克隆、序列分析及組織表達(dá)譜研究
　　對(duì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到的5個(gè)CSP可能序列CpalCSP3、CpalCSP4、Cpal CSP14、Cpal CSP15、CpalCSP16，經(jīng)PCR克隆驗(yàn)證后進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示，這5個(gè)CSP均具有典型CSP的序列特征，包括4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)及其特定排列模式C-X6-C-X18-C-X2-C;進(jìn)化分析表明5個(gè)CSP主要形成兩大分支。進(jìn)一步對(duì)這5個(gè)CpalCSP基因

4、進(jìn)行RT-qPCR分析，發(fā)現(xiàn)CpalCSP3主要在雌雄成蟲(chóng)頭部高表達(dá);CpalCSP4、CpalCSP14、CpalCSP16則在觸角中高表達(dá)或特異表達(dá);CpalCSP15在觸角和頭部均有較高表達(dá)。就觸角中的表達(dá)量而言，CpalCSP14顯著高于其余4個(gè)基因。CpalCSP基因在觸角或頭部高表達(dá)，暗示它們可能在大草蛉的嗅覺(jué)或味覺(jué)中起作用，并且以CpalCSP14在嗅覺(jué)中的作用最為重要。
　　2、大革蛉化學(xué)感受蛋白的原核表達(dá)及與氣味

5、物質(zhì)的結(jié)合能力分析
　　采用原核表達(dá)和親和層析純化技術(shù)得到CpalCSP3、CpalCSP4、CpalCSP14、CpalCSP15和CpalCSP16重組蛋白。進(jìn)一步利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了5個(gè)CpalCSP對(duì)85種不同氣味物質(zhì)的結(jié)合能力。結(jié)果表明，CpalCSP3與橙花叔醇、(+)-雪松醇和β-紫羅蘭酮具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，Ki值為8.79-9.79肛M;與根皮苷、月桂醛、乙酸香葉酯和α-蒎烯也有較強(qiáng)的結(jié)合能力，Ki值為11

6、.54-19.06μM。CpalCSP14與醛類(lèi)、脂類(lèi)、萜烯類(lèi)物質(zhì)均有較高的結(jié)合能力（Ki＜20μM）;與己酸葉醇酯和乙酸苯乙酯具有極強(qiáng)的結(jié)合能力，Ki值為0.74-1.12μM。其他3個(gè)CSP(CaplCSP4、CaplCSP15、CaplCSP16)與配基的結(jié)合能力相對(duì)較弱。分析認(rèn)為，CpalCSP3和CpalCSP14可能參與相應(yīng)氣味物質(zhì)的結(jié)合與運(yùn)輸，在大草蛉對(duì)這些氣味的嗅覺(jué)感受中起作用。
　　3、大草蛉成蟲(chóng)對(duì)幾種信息化合物

7、的觸角電位及行為反應(yīng)測(cè)定
　　根據(jù)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果，選取其中與CpalCSP具有較強(qiáng)結(jié)合能力的23種配體進(jìn)行了觸角電位反應(yīng)測(cè)定。結(jié)果表明，大草蛉雄蟲(chóng)對(duì)于癸醛、己醛、苯乙醛、β-紫羅蘭酮、橙花叔醇、苯甲酸乙酯、月桂醛及香葉醇具有較高的EAG反應(yīng)相對(duì)值(EAG＞1);大草蛉雌蟲(chóng)對(duì)于癸醛、己醛、苯乙醛、己酸葉醇酯、月桂醛、苯甲酸乙酯、β-紫羅蘭酮、苯乙醇、苯甲醇及3-己烯醛具有較高的EAG反應(yīng)相對(duì)值(EAG＞1)。進(jìn)一步利用Y型嗅覺(jué)儀