退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞衰老及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞衰老的表現(xiàn)以及氧化應(yīng)激對(duì)終板軟骨細(xì)胞衰老的影響，探討SIRT1對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的終板軟骨細(xì)胞衰老的調(diào)控作用以及相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步揭示椎間盤軟骨終板的退變機(jī)制提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：取因腰椎爆裂骨折（LVF組，退變輕）及椎間盤退變性疾?。―DD組，退變嚴(yán)重），行椎間盤切除術(shù)的椎間盤組織分離得到終板軟骨組織，進(jìn)行大體標(biāo)本觀察、組織學(xué)檢測(cè)（常規(guī)HE染色，免疫組織化學(xué)染色），觀察不同退變程度終板軟骨組織

2、中細(xì)胞的外形及SIRT1、p53、p21、p16蛋白表達(dá)情況。
　　提取原代終板軟骨細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增、培養(yǎng)；并采用致死量以下的H2O2進(jìn)行氧化應(yīng)激處理，觀察對(duì)細(xì)胞的影響，構(gòu)建細(xì)胞衰老模型；并采用流式細(xì)胞儀、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色、定量PCR、WB等方法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡、周期分布，以及細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)通路的激活情況。
　　構(gòu)建高表達(dá)SIRT1的腺病毒Ad-SIRT1并驗(yàn)證其表達(dá)及功能，以Ad-GFP為對(duì)照，并應(yīng)用SIRT1

3、基因特異性抑制劑nicotinamide、p53特異性抑制劑PFT-α，調(diào)控SIRT1表達(dá)及衰老相關(guān)信號(hào)通路的活性后，采用流式細(xì)胞儀、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色、免疫熒光、定量PCR、WB等方法檢測(cè)細(xì)胞的周期分布，以及衰老相關(guān)基因的表達(dá)的定位及定量情況。進(jìn)而探討SIRT1對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的終板軟骨細(xì)胞衰老的調(diào)控作用及機(jī)制。
　　結(jié)果：DDD組椎間盤終板軟骨組織較LVF組顏色偏黃，鈣化明顯，HE染色顯示其大多細(xì)胞相對(duì)變扁，而LVF組細(xì)

4、胞相對(duì)成圓形。免疫組織化學(xué)提示DDD組SIRT1陽性細(xì)胞率較LVF組明顯減少（P＜0.05），而DDD組p53、p21的陽性細(xì)胞率較LVF組明顯增加（P＜0.05），而p16的陽性細(xì)胞率兩組中尚未見明顯差異（P＞0.05），DDD組原代細(xì)胞中衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞率明顯高于LVF組（P＜0.05）。
　　致死量以下H2O2進(jìn)行氧化應(yīng)激處理終板軟骨P2代細(xì)胞后，兩組（Control組、H2O2組）細(xì)胞凋亡率未見明顯差異（

5、P＞0.05），而細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞的比例H2O2組明顯高于Control組（P＜0.05），且衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞率 H2O2組明顯高于Control組（P＜0.05），并且H2O2組中II型膠原的表達(dá)明顯降低，而MMP13的表達(dá)明顯增高；p53乙酰化水平及p21的mRNA及蛋白水平H2O2組都明顯高于Control組（P＜0.05），p38磷酸化水平及p16的mRNA及蛋白水平H2O2組與Control組未見明顯差異

6、（P＞0.05）。
　　腺病毒過表達(dá)SIRT1后，H2O2+Ad-SIRT1組較對(duì)照組（H2O2組）明顯抑制p53乙?；郊耙种苝21的表達(dá)（P＜0.05），同時(shí)降低β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞率（P＜0.05），并使得細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞的比例明顯降低（P＜0.05）；而H2O2+Nic組抑制SIRT1的表達(dá)后，較對(duì)照組（H2O2組）明顯增加了p53乙?；郊皃21的表達(dá)（P＜0.05），衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞率增

7、高（P＜0.05），同時(shí)細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞的比例明顯增高（P＜0.05）。
　　在氧化應(yīng)激條件，細(xì)胞免疫熒光染色提示SIRT1定位于細(xì)胞核內(nèi)，而p53出現(xiàn)明顯向細(xì)胞核內(nèi)聚集，進(jìn)一步提示SIRT1與p53可能存在相互作用。而H2O2+Nic+PFT-α組在氧化應(yīng)激下使用Nic抑制SIRT1，激活p53/p21信號(hào)通路后，再使用p53特異性抑制劑PFT-α后，p21的表達(dá)水平較 H2O2+Nic組明顯降低（P＜0.05），同時(shí)衰老相

8、關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞率降低（P＜0.05），細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞的比例也明顯降低（P＜0.05），同時(shí)與單純氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞衰老后直接加入PFT-α即H2O2+PFT-α組比較，p21的表達(dá)水平、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞率、G1期細(xì)胞的比例并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步提示p53/p21是SIRT1調(diào)控氧化應(yīng)激條件下終板軟骨細(xì)胞衰老的重要信號(hào)通路。
　　結(jié)論：退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞存在明顯衰老表型，而氧化應(yīng)激條件下p