光皮樺天然群體遺傳多樣性研究.pdf

1、運(yùn)用表型標(biāo)記和RAPD標(biāo)記對(duì)福建境內(nèi)9個(gè)光皮樺(Betula luminifera H.Winkl.)天然群體共135個(gè)個(gè)體樣本進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，初步揭示了研究群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀及其分布格局，同時(shí)對(duì)兩種標(biāo)記方法進(jìn)行了比較分析，旨在為光皮樺種質(zhì)資源的保護(hù)、遺傳改良以及永續(xù)利用提供依據(jù)。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.對(duì)9個(gè)光皮樺天然群體135個(gè)單株的7個(gè)葉片性狀、3個(gè)果序性狀及5個(gè)種子Jl生狀等15項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行

2、表型多樣性分析，探討群體間和群體內(nèi)的表型變異程度與規(guī)律。結(jié)果表明，光皮樺種內(nèi)表型性狀在群體間和群體內(nèi)存在豐富的遺傳變異：光皮樺葉、果序和種子3類表型性狀的變異系數(shù)分別為0.1779、0.1056和0.1930，其中果序性狀穩(wěn)定性高于葉性狀和種子性狀；群體間平均表型分化系數(shù)(Vst)為0.3503，群體間的變異(35.03％)小于群體內(nèi)的變異(64.97％)：群體內(nèi)表型變異系數(shù)由大到小的排序?yàn)椋簑p(o.1288)>YA(0.1264)>

3、LC(0.1153)>YX(0.1126)>sw(0.1078)>WY(0.0966)>MX(0.0953)>SX(0.0755)>SL(0.0509)。光皮樺表型性狀間及其與地理氣候因子相關(guān)分析表明，光皮樺表型性狀間存在顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系，種內(nèi)群體的葉、果序、種子性狀變異也存在較明顯的地理變異趨勢(shì)。聚類分析將9個(gè)光皮樺天然群體劃分為3類：SX、MX、LC、YA和WP五個(gè)群體聚為一類，SW、WY和YX三個(gè)群體聚為一類，SL群體獨(dú)立為一

4、類。 2.通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)，建立了光皮樺基因組DNA的簡(jiǎn)便提取方法和葉片保存方法；通過(guò)參數(shù)優(yōu)化，篩選出一套適合于光皮樺RAPD反應(yīng)的擴(kuò)增程序和擴(kuò)增體系。 (1)為從富含次生代謝物的光皮樺嫩葉中獲得高質(zhì)量的DNA，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了5種先提核再提DNA的CTAB法Ⅰ、CTAB法Ⅱ、CTAB法Ⅲ、CTAB法Ⅳ和改良的SDS法，應(yīng)用于光皮樺基因組DNA的提取，并采用瓊脂糖凝膠電泳、A<,260/A280>比值測(cè)定、限制性內(nèi)切酶消化和PCR

5、擴(kuò)增等對(duì)所提取的DNA進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明：用改良的CTAB法Ⅰ提取的DNA完全可滿足RAPD分析的要求。 (2)以光皮樺新鮮嫩葉為對(duì)照，比較了-20℃冷藏、硅膠干燥、改進(jìn)的飽和NaCI-CTAB溶液保存和核分離緩沖液固定4種鮮葉保存方法對(duì)光皮樺基因組DNA提取效果的影響，并以提取的核酸得率、純度、片段分布情況、是否含有PCR反應(yīng)抑制劑等指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)其保存效果。結(jié)果表明：-20℃冷藏的樣品未能提到DNA；鮮葉、改進(jìn)的飽和NaC

6、l-CTAB溶液保存和核分離緩沖液保存的葉片均能提到純度較好的DNA，大小在48kb左右，得率約為400 μgg<'-1>鮮葉，并獲得條帶清晰、多態(tài)性好的PCR擴(kuò)增圖譜;用硅膠干燥保存的葉片也能提到DNA，但得率低(51.2 μg.g<'-1>鮮葉)，且未獲得條帶完整、清晰的PCR擴(kuò)增圖譜。 (3)為確保RAPD反應(yīng)結(jié)果的重復(fù)性和真實(shí)性，對(duì)RAPD反應(yīng)的變性時(shí)間、退火溫度和退火時(shí)間進(jìn)行篩選，優(yōu)選的程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性300s；

7、94℃變性30s，40℃退火90s，72℃延伸120s，循環(huán)41次；最后在72℃延伸300s。同時(shí)，采用單因素設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)對(duì)光皮樺的RAPD反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)兩種設(shè)計(jì)方案優(yōu)化出的最佳反應(yīng)體系的可靠性和穩(wěn)定性進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明：兩種設(shè)計(jì)均可用于光皮樺RAPD體系的優(yōu)化，但單因素設(shè)計(jì)受多因素間交互作用的影響使RAPD反應(yīng)體系達(dá)不到最優(yōu)；而均勻設(shè)計(jì)能避免盲目性，可快速得到條帶清晰、穩(wěn)定性好的擴(kuò)增帶譜。通過(guò)兩次均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化，得出適合

8、光皮樺RAPD反應(yīng)的擴(kuò)增體系為：dNTP0.2 mmol·L<'-1>，引物0.4μmol·L<'-1>，模板30 ng·20μL<'-1>，MgCl<,2> 2.5 mmol·L<'-1>，Taq DNA聚合酶1 U·20μL<'-1>。 3．利用RAPD標(biāo)記對(duì)9個(gè)光皮樺天然群體共135個(gè)個(gè)體的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明：21個(gè)隨機(jī)寡核苷酸引物共檢測(cè)到225個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)203個(gè)，占90.22％：物種水

9、平的Shannon多樣性指數(shù)I=0.4908，Nei’s基因多樣度h=0.3323 綜合評(píng)價(jià)9個(gè)群體，YA群體的DNA水平遺傳多樣性最高，其次是WP、SX、LC、WY、MX、SW、YX，而SL群體DNA水平的遺傳多樣性最低。分子方差分析(AMOVA)結(jié)果表明，光皮樺群體的遺傳變異主要存在于群體內(nèi)(占71.31％)，群體間的變異組分只占28.69％，這與利用Shannon多樣性指數(shù)估算的分化(Hsp-Hpop)IHsp=O.3250和Ne

10、i’s遺傳分化系數(shù)Gst=O.2809的結(jié)果相一致。UPGMA聚類分析將9個(gè)群體分為3個(gè)不同類群：YA、MX、WP、LC、YX群體為一類，SX、SW、WY群體為一類，SL群體單獨(dú)為一類。 4．從實(shí)驗(yàn)樣本、遺傳多樣性參數(shù)、遺傳多樣性的梯度變異、遺傳多樣性分布和遺傳多樣性評(píng)價(jià)的應(yīng)用等方面進(jìn)行光皮樺天然群體表型標(biāo)記和RAPD標(biāo)記的比較分析。結(jié)果表明：RAPD標(biāo)記揭示的種內(nèi)遺傳多樣性水平比表型標(biāo)記高，群體分化以表型的分化水平(Vst=