長效棘白菌素類化合物BG40018抗真菌藥效、藥代動力學和一般毒性研究.pdf

1、真菌感染是對人與動物危害最嚴重的人畜共患病之一，已知大約100種真菌對人和動物是具有致病性的。機會性和侵襲性真菌感染已經(jīng)成為免疫缺陷病人（如HIV、癌癥患者和器官移植病人）發(fā)病和死亡的主要原因[1-4]。在過去幾十年里，真菌發(fā)病率以驚人的速度增長。據(jù)報道，系統(tǒng)性真菌感染的病死率超過30％[5-7]。目前臨床常用的抗深部真菌藥物是唑類和兩性霉素B。原發(fā)性和機會性致病真菌不斷出現(xiàn)耐藥以及藥物對宿主的毒性問題使臨床迫切需要開發(fā)新的抗真菌藥物[

2、8-12]。棘白菌素類藥物屬于脂肽抗真菌藥物，通過非競爭性抑制真菌細胞壁(1，3)-β-D-葡聚糖合成酶，葡聚糖合成酶是保持真菌細胞壁完整性的必要成分[13]。由于哺乳動物沒有細胞壁，故該類藥對人體的毒性較低，副作用較少。與其它抗真菌藥物相比，棘白菌素類藥物不易產(chǎn)生耐藥且沒有藥物-藥物相互作用[14]，是目前一種重要的治療嚴重深部真菌感染藥物[15]。阿尼芬凈屬于第三代棘白菌素類的半合成抗真菌藥，對所有念珠菌，包括對唑類和多烯類耐藥的念

3、珠菌屬，具有較強的殺菌作用，同時對曲霉菌也有一定的抑制作用[16,17]。然而阿尼芬凈溶解性較差，臨床使用需要毒性較大的增溶劑（如:吐溫80等），臨床每天給藥成本較高，這在一定程度上限制了其臨床應用[18]。
　　改善水溶性并延長其半衰期的各種策略廣泛應用于阿尼芬凈的結構改造。BG40018是對阿尼芬凈結構修飾而得到的發(fā)酵半合成棘白菌素類藥物，通過抑制真菌細胞壁(1，3)-β-D-葡聚糖合成酶而發(fā)揮抗真菌作用。本課題對BG4001

4、8的體外活性、體內(nèi)活性、藥代動力學特征和安全性進行研究，為BG40018的使用和進一步開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　1.BG40018體外抗真菌活性研究
　　為研究BG40018對酵母菌和霉菌的體外抗真菌活性。按照臨床和實驗室標準品研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute)M38-A2和M27-A3文件所述程序對BG40018體外抗念珠菌屬的最低抑菌濃度(MIC)進行了測定，同

5、時以阿尼芬凈為對照藥物。藥物經(jīng)倍比稀釋至指定濃度范圍，RPMI1640培養(yǎng)液加入嗎啉基丙磺酸(MOPS)并調(diào)節(jié)pH至7.0，起始接種濃度為0.5×103～2.5×103CFU/mL。念珠菌微量滴定板在孵箱中35℃培養(yǎng)24h后讀取MIC值，新生隱球菌培養(yǎng)72h后讀取MIC值。MIC值判定為肉眼觀察到相當于生長對照有50％生長減少時的最低藥物濃度。結果表明:BG40018對念珠菌的MIC值≤0.125μg/mL，BG40018和阿尼芬凈的活

6、性相當，MIC值差距在2個梯度以內(nèi)。兩者對新生隱球菌和曲霉菌的體外抗真菌活性較弱。以上結果表明BG40018對氟康唑敏感和耐藥的念珠菌包括光滑念珠菌和克柔念珠菌均有較強的抗真菌活性，活性與阿尼芬凈相當。
　　2.BG40018體外抗真菌的時間-效應關系研究
　　通過時間-殺菌曲線實驗進一步確認BG40018抗真菌活性以及作用的時效特點。將白色念珠菌SC5314，熱帶念珠菌ATCC20026，克柔念珠菌ATCC2340和新生隱

7、球菌H99菌懸液稀釋至1×105CFU/mL，加入2μg/mL的BG40018或阿尼芬凈，35℃振蕩培養(yǎng)，分別于0、4、8、12、16和24h，所有菌液中各取100μL液體，以去離子水梯度稀釋，從各時間點菌液中各取100μL均勻涂鋪于SDA固體培養(yǎng)基表面。35℃培養(yǎng)48h后計數(shù)菌落數(shù)目。結果表明:BG40018和阿尼芬凈對白色念珠菌SC5314、克柔念珠菌ATCC2340和熱帶念珠菌ATCC20026均具有較強的抑菌作用，BG40018

8、處理24h后的菌落總數(shù)比阿尼芬凈處理的下降了0.8～1.1Log10CFU/mL。兩種藥物對新生隱球菌H99抑菌效果較弱，但BG40018處理24h后的菌落總數(shù)與阿尼芬凈相比下降了0.4Log10CFU/mL，表明BG40018體外抗殺菌速率略好于阿尼芬凈。
　　3.BG40018在小鼠體內(nèi)的抗真菌活性研究
　　為比較BG40018和阿尼芬凈對系統(tǒng)性白色念珠菌SC5314感染小鼠體內(nèi)抗真菌活性。在給藥前第4和第1d，腹腔注射

9、150mg/kg環(huán)磷酰胺誘導小鼠產(chǎn)生免疫缺陷。給藥前2h尾靜脈注射1×104CFU/只(0.1mL)白色念珠菌SC5314建立系統(tǒng)性真菌感染模型。感染2h后單次尾靜脈給予0.5、1.5和4.5mg/kg的BG40018或阿尼芬凈溶液;給藥24h后，處死小鼠后，取右側腎臟加入PBS勻漿，勻漿液涂鋪于SDA固體培養(yǎng)基表面，于35℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后計數(shù)菌落數(shù)目。左側腎臟經(jīng)由10％中性福爾馬林液中固定，切片后進行HE染色和PAS染色。在

10、另一實驗中，小鼠感染2h后尾靜脈注射1.5mg/kg BG40018或阿尼芬凈溶液，模型組于感染2h后尾靜脈給予生理鹽水。給藥后每天觀察小鼠死亡情況，共觀察25天，計算存活百分率和中位生存期。結果表明:給藥24h后，BG40018和阿尼芬凈在0.5mg/kg劑量水平對系統(tǒng)性真菌感染小鼠抗真菌活性稍弱，1.5和4.5mg/kg均可顯著降低系統(tǒng)性真菌感染小鼠的腎臟載菌量，其中BG40018抗真菌活性略優(yōu)于阿尼芬凈。PAS染色結果顯示:與感染

11、對照組相比，BG40018和阿尼芬凈均可顯著降低腎臟中菌絲態(tài)白色念珠菌。HE染色結果表明:與阿尼芬凈組相比，BG40018處理小鼠腎臟損傷略有改善。生存率實驗中，對照組小鼠在系統(tǒng)性真菌感染后3d全部死亡，BG40018組小鼠在感染后25d僅個別動物死亡。BG40018組生存率與等劑量阿尼芬凈組相比顯著提高。對照組小鼠中位生存期為2天，BG40018組和阿尼芬凈組小鼠中位生存期分別為＞25和24.5天。上述結果表明:在系統(tǒng)性真菌感染小鼠中

12、，與阿尼芬凈相比，BG40018在降低腎臟載菌量、改善腎臟病變和提高生存率等方面表現(xiàn)出更好的活性。
　　4.BG40018在比格犬體內(nèi)藥代動力學研究
　　為研究BG40018和阿尼芬凈靜脈給藥后在比格犬體內(nèi)的藥代動力學特征。將實驗比格犬經(jīng)靜脈推注給予1mg/kg BG40018或阿尼芬凈，使用K2EDTA抗凝管從頸靜脈最長至給藥后72h，4℃離心分離血漿，低于-70℃保存。用LC-MS/MS方法分析血漿中BG40018或阿尼

13、芬凈濃度。乙腈沉淀血漿蛋白后從基質中提取BG40018或阿尼芬凈，隨后以去離子水進行液液萃取。利用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(50×2.1mm，3.5μm)或SB-C18(50×2.1mm，5μm)色譜柱，在室溫進行梯度洗脫，流動相為水(0.1％甲酸)和乙腈∶水=95∶5（含0.1％甲酸），流速為0.4mL/min。采用API4000(Applied Biosystems)ESI正離子化方式檢測，掃描方

14、式為多反應監(jiān)測(MRM)，用于定量分析的離子對為BG40018:m/z1217.2→104.1(IS:m/z455.2→165.1);阿尼芬凈m/z1140.7→343.3（IS:m/z494.2→369.1），采用WinNonlin軟件非房室模型計算藥動學參數(shù)。結果表明:經(jīng)靜脈10mm推注后，BG40018在體內(nèi)清除緩慢(CL=0.208mL/min/kg，t1/2=51h)，AUC0-inf和Vdss分別為80730ng·h/mL和

15、0.794L/kg。阿尼芬凈在體內(nèi)清除較快(CL=0.748mL/min/kg，t1/2=17h)，AUC0-inf和Vdss分別為22396ng·h/mL和0.835L/kg。這說明與阿尼芬凈相比，BG40018的半衰期顯著延長，有利于提高系統(tǒng)暴露量。
　　5.BG40018對SD大鼠的重復給藥毒性研究
　　為評價BG40018連續(xù)給藥對SD大鼠的安全性。將實驗SD大鼠（5/性別/組）尾靜脈14d連續(xù)注射給予BG40018

16、（0、10、20和40mg/kg）或阿尼芬凈(40mg/kg)，評價藥物對臨床癥狀、體重、血液常規(guī)、血液生化、血凝、尿液檢查、剖檢和肉眼觀察、臟器重量和組織病理學檢查的影響。結果表明:BG40018各劑量組動物在臨床癥狀、體重、血液學、血清生化、血凝、尿液分析、主要臟器大體觀察、臟器系數(shù)和病理學檢查中未發(fā)現(xiàn)明顯變化。阿尼芬凈組則表現(xiàn)出體重降低，RBC、HGB、HCT、MCV、MCHC、PLT、MPV和RET＃呈降低趨勢，AST和ALT顯

17、著升高，剖檢主要可見肝臟腫大，鏡檢可見肝細胞肥大和單個肝細胞壞死，其他臟器無明顯變化。根據(jù)文獻:阿尼芬凈在大鼠體內(nèi)最高非致死劑量為50mg/kg，相當于治療食道念珠菌感染推薦劑量(50mg/day)的10倍或念珠菌血癥以及其它念珠菌感染推薦劑量(100mg/day)的5倍（根據(jù)體表面積折算），大鼠毒性實驗觀察到肝臟毒性包括單個肝細胞壞死，肝細胞肥大和肝臟重量增加，推測由于其化學不穩(wěn)定性，產(chǎn)生潛在的毒性代謝產(chǎn)物。本實驗阿尼芬凈的毒性特征與