幽門螺桿菌可塑區(qū)hpsh0459基因生物學(xué)功能研究.pdf

1、目的:
　　幽門螺桿菌(H.pylori) Hpsh0459蛋白由位于H.pylori可塑區(qū)(TnPZ)中的hpsh0459基因編碼，有研究認(rèn)為該基因的編碼產(chǎn)物可以與H.pylori TnPZ中的其他基因(virB4, virB8, virB9, virB11，virD4和virD2)編碼產(chǎn)物共同構(gòu)成一個(gè)新的Ⅳ型分泌系統(tǒng)(tfs3a)。目前國內(nèi)外尚缺乏對hpsh0459基因及其編碼產(chǎn)物Hpsh0459的功能及相關(guān)致病機(jī)制的研究報(bào)道

2、。本文以H.pylori臨床分離菌株WH-21為研究對象，通過分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和免疫學(xué)等技術(shù)手段對hpsh0459基因及其編碼產(chǎn)物Hpsh0459的功能進(jìn)行了探究，為深入研究其在H.pylori致病機(jī)制中的地位及作用奠定了基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.將H.pylori WH-21菌株于微需氧環(huán)境中在Karmali培養(yǎng)基上培養(yǎng)，采用PCR手段，以H.pylori WH-21菌株基因組為模板，用特異性引物擴(kuò)增hpsh045

3、9基因片段，經(jīng)測序后得到核酸序列，并推導(dǎo)出編碼氨基酸序列。采用生物信息學(xué)，分析hpsh0459基因推導(dǎo)蛋白的基本理化性質(zhì)、細(xì)胞定位、信號(hào)肽及空間結(jié)構(gòu)等相關(guān)信息;
　　2.構(gòu)建hpsh0459基因的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta(DE3)中，以IPTG誘導(dǎo)宿主表達(dá)融合蛋白Hpsh0459。用Ni2+-NTA親和層析柱對融合蛋白進(jìn)行純化，并采用Western blot對其所攜帶的His標(biāo)簽進(jìn)行鑒定。以純化后的Hpsh

4、0459為抗原，通過免疫家兔制備抗-Hpsh0459多克隆抗體，抗體效價(jià)通過ELISA方法測定;
　　3.將不同濃度的純化Hpsh0459蛋白與人正常胃上皮細(xì)胞GES-1進(jìn)行共培養(yǎng)，用MTT方法研究其細(xì)胞毒性。將共培養(yǎng)后的上清培養(yǎng)液收集，用IL-8檢測試劑盒(ELISA)法檢測其中的IL-8含量;
　　4.采用低溫超速離心法將H.pylori WH-21菌株的菌體成分裂解為不同的亞細(xì)胞組分，以兔抗Hpsh0459多克隆抗體為

5、一抗，以免疫印跡法對Hpsh0459的亞細(xì)胞定位進(jìn)行檢測。用免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析的手段，探究Hpsh0459的互作蛋白;
　　5.構(gòu)建hpsh0459基因敲除載體，用于建立hpsh0459的基因缺失株。
　　結(jié)果:
　　1.以H.pylori WH-21菌株為模板，成功獲得了長度為1233bp的hpsh0459基因全長片段。生物信息學(xué)分析顯示，該基因可編碼分子量為46.31 kDa的蛋白質(zhì)，該蛋白由411個(gè)氨基組成。

6、該蛋白的等電點(diǎn)為9.45，屬于無信號(hào)肽的親水性穩(wěn)定蛋白，其抗原位點(diǎn)聚集于C端，空間結(jié)構(gòu)呈通道狀，提示Hpsh0459蛋白可能參與細(xì)胞生物大分子的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　2.構(gòu)建了hpsh0459基因的原核表達(dá)載體pET28a-hpsh0459(633bp)，經(jīng)誘導(dǎo)純化后獲得了高純度的Hpsh0459的C端蛋白。通過免疫家兔，獲得了效價(jià)為1∶32，000的兔抗-Hpsh0459多克隆抗體。
　　3.Hpsh0459蛋白與GES-1共培養(yǎng)后

7、，通過MTT實(shí)驗(yàn)和ELISA法對Hpsh0459蛋白的細(xì)胞毒性和上清液IL-8含量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明Hpsh0459蛋白的細(xì)胞毒性有濃度依賴性，Hpsh0459濃度為0.1μg/mL時(shí)的細(xì)胞抑制率明顯低于Hpsh0459濃度為20μg/mL時(shí)的細(xì)胞抑制率（3.02％±0.02％vs57.57％±0.03％，p＜0.01）。隨共培養(yǎng)時(shí)間的延長，24h(1316.31±212.78 pg/mL)和12h(1043.44±210.88 pg

8、/mL)的IL-8水平明顯高于共培養(yǎng)6h的IL-8水平(97.22±11.47 pg/mL，p＜0.01)。表明該蛋白能明顯刺激細(xì)胞IL-8的分泌，與宿主炎癥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。
　　4.以兔抗-Hpsh0459多克隆抗體為一抗，分別采用免疫印跡法和免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析的方法明確了Hpsh0459蛋白的亞細(xì)胞定位及互作蛋白。結(jié)果表明，Hpsh0459定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞周質(zhì)上，與鋅指蛋白和蛋氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)ATP結(jié)合蛋白等存在相互作用。

9、>　　5.成功構(gòu)建了hpsh0459基因的敲除載體pBlueKM40-△ hpsh0459∷kan。
　　結(jié)論:
　　1.通過信息分析，明確了Hpsh0459是一種高親水性的穩(wěn)定性蛋白，有較強(qiáng)的抗原性，該蛋白與VirB10、TrbI家族蛋白具有較高的同源性。其空間結(jié)構(gòu)呈中空的通道狀，可能與周邊的其他virB基因組成一個(gè)新的T4SS。
　　2.通過構(gòu)建hpsh0459原核表達(dá)載體pET-28a-hpsh0459(633b