固定化β-葡萄糖醛酸苷酶在18α-甘草酸生物轉(zhuǎn)化體系的應(yīng)用.pdf

1、β-葡萄糖醛酸苷酶(β-GUS)，是人體重要的酸性水解酶，參與機體的生理、病理及藥物的代謝等過程，能特異性水解葡萄糖醛酸苷鍵并釋放出葡萄糖醛酸及其配基。天然存在的甘草酸主要為18β-甘草酸(18β-GL)，在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為差向異構(gòu)體18α-甘草酸(18α-GL)，其抗炎作用強，肝臟靶向性高，副作用小，安全性強，更適用于臨床肝病的治療。由于18β-GL能在β-GUS的作用下水解失去一分子葡萄糖醛酸基，得到具有更甜味性能以及生物活性的

2、18β-GAMG，因而應(yīng)用β-GUS對18α-GL進行分子結(jié)構(gòu)改造，有望得到比18α-GL生物活性相似或更高，且具有靶向性的化合物。
　　 本文以18α-甘草酸為原料，運用鴨肝β-GUS作為催化劑，特異性水解其遠端葡萄糖醛酸基，成功制備了新化合物18α-單葡萄糖醛酸甘草次酸(18α-GAMG)。同時針對酶轉(zhuǎn)化過程中存在的酶運行周期短的缺點，采用固定化技術(shù)對β-GUS進行優(yōu)化，并將固定化酶應(yīng)用到18α-GL的轉(zhuǎn)化體系中。論文主要工

3、作如下：
　　 1.酶轉(zhuǎn)化體系中18α-GL及18α-GAMG分析方法的建立：
　　 建立了在酶轉(zhuǎn)化體系中反向HPLC法測定18α-GL及18α-GAMG的方法。采用Apollo C18分析柱(4.6×250 mm，5μm)，流動相為V(甲醇)：V(水)：V(冰醋酸)=80:20:5。在線性范圍0.2～20μg內(nèi)，18α-GL的線性回歸方程為：C=5.24×10-6×A+6.26×10-3，r=0.9998；18α-GA

4、MG的線性回歸方程為：C=4.01×10-6×A+6.90×10-3，r=0.9991。精密度試驗：18α-GL的RSD值為1.60％；18α-GAMG的RSD值為1.79％。加樣回收率試驗：18α-GL的回收率為99.1％～100.3％，RSD為1.18％～1.47％；18α-GAMG的回收率為96.0％～98.7％，RSD為0.90％～2.12％。當信噪比為2時，18α-GL的最小檢測限為46 ng；18α-GAMG的最小檢測限為3

5、2 ng。
　　 2.β-GUS在18α-GL轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用：
　　 應(yīng)用鴨肝制備的β-GUS酶粉用于18α-GL轉(zhuǎn)化的研究，對反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，得出酶粉轉(zhuǎn)化18α-GL制備18α-GAMG的最適溫度為45℃，最適pH為6.0。
　　 3.β-GUS的固定化及其在18α-GL轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用：
　　 (1)通過不同凝膠包埋體系的試驗，確定卡拉膠作為包埋β-GUS的載體。對卡拉膠固定化體系進行優(yōu)化，選擇4％膠濃

6、度，加酶量0.75g/g，KCl溶液濃度0.4 mol/L，固定化時間為4 h的基本固定條件。
　　 (2)研究固定化酶的穩(wěn)定性，結(jié)果表明其溫度穩(wěn)定性范圍在50℃以下，pH穩(wěn)定性范圍在5～7。這與酶粉的穩(wěn)定性相似，這是由于卡拉膠本身通透性較好，溫度、pH的變化能夠直接影響酶的性質(zhì)。該固定化酶用于轉(zhuǎn)化18α-GL，每12 h一批，連續(xù)反應(yīng)10批后，相對酶活仍保持在75％。
　　 (3)應(yīng)用固定化酶轉(zhuǎn)化18α-GL生產(chǎn)18α