乙型肝炎病毒X蛋白抑制Wnt信號(hào)通路拮抗因子的表達(dá)及分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：全世界約有3億人感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)，中國(guó)約占1/3。中國(guó)作為乙型肝炎的高流行區(qū)，HBV表面抗原攜帶人數(shù)占全球總感染人數(shù)的近50％[1]。此外，患慢性肝炎的病人中約有80％以上為慢性乙型肝炎患者，而HBV慢性感染人群罹患原發(fā)性肝細(xì)胞癌的相對(duì)危險(xiǎn)性至少增加300倍[2]。HBV屬嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，基因組長(zhǎng)約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。其基因組共有四個(gè)開放

2、閱讀框架(open reading frame，ORF)，分別稱為S、C、P、X區(qū)。S區(qū)可分為S基因區(qū)和前S基因區(qū)兩部分。S基因編碼HBsAg，它是病毒的包膜蛋白，介導(dǎo)病毒感染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。前S基因位于S基因讀碼框架之前，分別編碼Pre S1和Pre S2蛋白。C區(qū)基因包括前C基因和C基因，分別編碼HBe和HBc蛋白，HBc蛋白參與病毒顆粒的組裝，在病毒的生活周期中發(fā)揮了重要作用。P區(qū)最長(zhǎng)，約占基因組75％以上，編碼病毒DNA多聚酶。X區(qū)

3、編碼154個(gè)氨基酸的X蛋白，其對(duì)病毒復(fù)制至關(guān)重要，并且生物學(xué)功能活躍，與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　HBx是HBV編碼的一種重要的病毒調(diào)控因子，可反式激活多種宿主和病毒基因轉(zhuǎn)錄，大量研究證實(shí)它在基因調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化等方面具有重要作用。研究表明HBx在促進(jìn)原發(fā)性肝癌的發(fā)生及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。
　　Wnt信號(hào)通路是廣泛存在于真核生物中的一條高度保守的信號(hào)通路，在胚胎的發(fā)育過(guò)程中起到重要

4、的作用。目前發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，如肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤。有研究發(fā)現(xiàn)在50-83％的肝癌中可以發(fā)現(xiàn)β-catenin的異?；罨渲幸駽TNNB1(β-catenin)基因突變等引起β-catenin的異?；罨瘍H占20％左右，HCC組織標(biāo)本中AXIN1，AXIN2基因的突變較少見，結(jié)腸腺瘤樣息肉基因(Adenomatous Polyposis Coli，APC)的失活突變至今未在HCC中發(fā)現(xiàn)，這也預(yù)示了在HCC

5、發(fā)生過(guò)程中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路其他分子的異常活化或者拮抗分子的失活可能參與了該信號(hào)通路的異?；罨?。
　　Wnt/β-catenin信號(hào)通路拮抗因子包括DKK家族和sFRP家族。sFRP家族含有5個(gè)分泌型的糖蛋白家族成員(sFRP1，2，3，4，5)，sFRP約有300個(gè)氨基酸殘基，包括一個(gè)同源的N2末端CRD和一個(gè)C2末端。sFRP結(jié)構(gòu)上與Wnt受體極為相似，具有同源的配體抑制區(qū)，但缺少7個(gè)編碼跨膜部分的結(jié)構(gòu)域。s

6、FRP具有相同的半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域，它們通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Fzd受體而抑制Wnt通路的活化。有研究表明，SFRPs基因的高甲基化修飾與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在結(jié)腸癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、肝癌等中都可發(fā)現(xiàn)SFRPs基因啟動(dòng)子區(qū)超甲基化修飾，而使其表達(dá)受到抑制。
　　有研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒X蛋白可通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，參與原發(fā)性肝癌(HCC)的發(fā)生，但具體機(jī)制不明。本研究擬在細(xì)胞水平明確H

7、Bx能否在表觀修飾水平調(diào)控sFRPs基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，并且深入分析HBx表觀調(diào)控sFRPs的分子機(jī)制。
　　方法：通過(guò)RT-PCR檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepG2.2.15、HepG2 H7細(xì)胞，以及采用腺病毒感染過(guò)表達(dá)HBx的HepG2細(xì)胞中sFRPs的表達(dá)；DAC處理后觀察上述細(xì)胞sFRPs表達(dá)變化。進(jìn)一步采用甲基化特異PCR(MSP)檢測(cè)上述細(xì)胞中sFRP1和sFRP5啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，采用亞重硫酸鹽DNA測(cè)序檢測(cè)H

8、Bx是否可以促進(jìn)sFRP1和sFRP5啟動(dòng)子區(qū)高甲基化修飾。通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)研究sFRP1和sFRP5啟動(dòng)子區(qū)重要的甲基化修飾酶Dnmt1、Dnmt3a以及組蛋白乙?；揎椕窰DAC1，P300等蛋白的結(jié)合情況，探討HBx蛋白對(duì)sFRPs基因表觀沉默的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：我們首先在HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15以及HepG2 H7細(xì)胞中觀察到Wnt信號(hào)抑制分子sFRP1、sFRP5的表達(dá)較對(duì)照細(xì)胞明顯下

9、調(diào)，這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象在HBx過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞系HepG2及Huh7中得到驗(yàn)證。進(jìn)一步采用DAC對(duì)細(xì)胞進(jìn)行去甲基化處理，上述基因的表達(dá)能部分回復(fù)，并且sFRP1、sFRP5基因表達(dá)的回復(fù)程度與DAC藥物的濃度呈劑量依賴關(guān)系。甲基化特異PCR以及亞重硫酸鹽測(cè)序?qū)嶒?yàn)均證實(shí)HBx可以誘導(dǎo)sFRP1、sFRP5基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化修飾。采用ChIP實(shí)驗(yàn)深入研究HBx表觀修飾sFRP1和sFRP5基因的分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)：HBx可以募集甲基化修飾酶DNMT

10、1、DNMT3A以及甲基化相關(guān)蛋白MBD1、MBD2結(jié)合于sFRP1啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)sFRP1啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化，同時(shí)還抑制組蛋白H3乙?；约癏AT(P300)結(jié)合于sFRP1啟動(dòng)子區(qū)，從而抑制sFRP1的表達(dá)。HBx還能招募DNMT3A、DNMT3B、MBD1、MECP2富集于sFRP5啟動(dòng)子區(qū)，對(duì)sFRP5的表達(dá)起表觀調(diào)控作用。
　　結(jié)論：乙型肝炎病毒X蛋白可招募甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A及甲基化相關(guān)蛋白MBD