GC-MS法測(cè)定生物樣品中有毒陰離子的研究.pdf

1、目的：由于氰化物和亞硝酸鹽具有廣泛存在性和劇毒性,它們一直是我國(guó)中毒案件中常見的毒物。氰化物和亞硝酸鹽的毒性主要由其分子在機(jī)體內(nèi)釋放出的無機(jī)陰離子-CN-和NO2-所引起,故其毒性強(qiáng)弱也主要取決于釋出陰離子的含量。因此快速準(zhǔn)確地檢測(cè)生物樣品中游離的CN-和NO2-,在毒物分析以及臨床醫(yī)學(xué)研究中具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。測(cè)定CN-和NO2-的方法有分光光度法、電化學(xué)法和色譜法。其中,氣相色譜/質(zhì)譜法(GC/MS)綜合了氣相色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn),

2、具有靈敏度高、分析速度快和鑒別能力強(qiáng)的特點(diǎn),可完成復(fù)雜生物樣品中痕量組分的定性和定量分析,在生物樣品分析中占有重要地位。但由于CN-和NO2-離子系水溶性無機(jī)陰離子,其強(qiáng)極性、水溶性和無揮發(fā)性限制了氣相色譜/質(zhì)譜在測(cè)定生物樣品中CN-和NO2-離子的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)的目的就是探索通過對(duì)生物樣品進(jìn)行一系列的前處理,對(duì)無機(jī)陰離子進(jìn)行濃縮富集,使其轉(zhuǎn)換成極性小、揮發(fā)性強(qiáng)的物質(zhì),進(jìn)行氣相色譜/質(zhì)譜分析,實(shí)現(xiàn)生物樣品中無機(jī)陰離子的快速、準(zhǔn)確分析。

3、r>　　 方法:
　　 1、GC/MS法測(cè)定血漿和尿中CN-的含量。在0.5mL血漿或尿中,加入0.5mL硼砂緩沖溶液(pH=10),加入5μL,0.1μg·μL-1(共計(jì)0.5μg)三溴苯(內(nèi)標(biāo));向上述溶液中加入苯甲醛,渦旋振蕩30s后,靜置5min;在15cm(高)×1.0cm(內(nèi)徑)的玻璃層析柱底端填入少許脫脂棉,然后填入1.5g硅藻土;將上述溶液轉(zhuǎn)移至硅藻土柱中,靜置10min;用混合溶液(5mL正己烷+20μL H

4、FB-Cl)洗脫,同時(shí)完成第二步衍生化;將脫出液置于通風(fēng)櫥內(nèi),N2下濃縮至近干,吸取1μL于GC/MS分析。
　　 2、GC/MS法測(cè)定血漿和尿中NO2-的含量。在0.5mL血漿或尿中,加入1mL磷酸緩沖溶液(pH=3),分別加入衍生化試劑2,3-DAN溶液和1,8-DAN溶液20μL,密封,渦旋震蕩30秒,于60℃水浴中加熱10min,冷卻后,加入內(nèi)標(biāo)SKF525A(0.1mg·mL-1)5μL;緩慢加入0.5g碳酸銨至上述溶

5、液中,調(diào)pH至8.5,渦旋振蕩.30s,直至CO2完全釋放;向上述溶液中加入2mL,乙酸乙酯萃取,震蕩1min,3500r/min離心5min;取上清液N2氣下濃縮至近干,吸取1μL進(jìn)行GC/MS分析。
　　 結(jié)果:生物樣品中的CN-和NO2-經(jīng)衍生化處理后,不僅改善了色譜行為,減小或消除了極性大的物質(zhì)可能產(chǎn)生的拖尾,還提高了檢測(cè)器對(duì)被測(cè)物的靈敏度,降低了目標(biāo)物的檢測(cè)限,衍生化產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)在設(shè)定的色譜質(zhì)譜條件下得到很好的分離且沒有

6、干擾,實(shí)現(xiàn)了生物樣品中CN-和NO2-的快速、準(zhǔn)確分析。在血漿樣品中CN-的LOD為0.04μg·mL-1,NO2-LOD為0.005μg·mL-1(2,3-DAN衍生化),NO2-LOD為0.01μg·mL-1(1,8-DAN衍生化);尿樣品中CN-的LOD為0.01μg·mL-1,NO2-LOD為0.001μg·mL-1(2,3-DAN衍生化),NO2-LOD為0.005μg·mL-1(1,8-DAN衍生化)。該方法的線性關(guān)系、精密

7、度、回收率均較好,衍生化產(chǎn)物在24h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。其中,NO2-測(cè)定中,2,3-DAN衍生化法在方法學(xué)方面優(yōu)于1,8-DAN衍生化法。
　　 討論:根據(jù)文中衍生物的色譜以及質(zhì)譜特征,分別討論了CN-和NO2-衍生化反應(yīng)的機(jī)理:CN-測(cè)定中涉及到兩步衍生化反應(yīng),第一步衍生化為苯甲醛與CN-的親核加成反應(yīng),第二步衍生化為上述產(chǎn)物與七氟丁酰氯的親核取代反應(yīng);NO2-測(cè)定中,二氨基萘和亞硝酸根離子發(fā)生重氮化反應(yīng),然后與萘環(huán)上的另一個(gè)氨

8、基進(jìn)行分子內(nèi)縮合成環(huán),生成偶氮亞氨基雜環(huán)化合物。文中分別探索了CN-和NO2-衍生化反應(yīng)過程中的影響因素:CN-測(cè)定中,討論了樣品pH值、氰離子和苯甲醛柱前反應(yīng)時(shí)間、苯甲醛用量對(duì)衍生化反應(yīng)的影響,最終確定pH值為10、氰離子和苯甲醛柱前反應(yīng)時(shí)間為5rain、苯甲醛為5μL時(shí)衍生化產(chǎn)物的響應(yīng)值最大;NO2-測(cè)定中,討論了樣品pH值、衍生化溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生化反應(yīng)的影響,最終確定pH值為3、在60℃下反應(yīng)10min時(shí)衍生化產(chǎn)物的響應(yīng)值最大

9、。文中分別對(duì)質(zhì)譜及色譜圖進(jìn)行了解析,探索了衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜裂解規(guī)律,并對(duì)色譜圖中的主要峰進(jìn)行歸屬分析。文中討論了在CN-測(cè)定中硅藻土柱的作用機(jī)理,即固相支持的液/液萃取,該方法集提取、衍生化、洗脫為一體,不僅簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過程,而且縮短了分析時(shí)間。文中分別將兩種方法與文獻(xiàn)方法進(jìn)行比較,證實(shí)本方法耗時(shí)更短、精密度和準(zhǔn)確度更高、操作更加簡(jiǎn)便安全。
　　 結(jié)論:本文探索了GC/MS測(cè)定生物樣品中有毒陰離子CN-和NO2-的實(shí)驗(yàn)方法。通過優(yōu)